] 結(jié)果表明，上述步驟一分離并純化得到的降解菌LGY06在牛肉膏蛋白胨固體平板 上生長很快，呈圓形或近似圓形、質(zhì)地軟、稍有光澤的白色菌落，生長較快。菌體細胞桿狀， 成短或長鏈，芽孢中生，無莢膜。電子顯微鏡下觀察桿狀細胞長直徑>1 μ m。
[0022] (2 )生理生化特征分析 參考《微生物學實驗》（沈萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗（第三版）.北京：高等 教育出版社，1999.)和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手 冊.北京：科學出版社，2011.)測定降解菌LGY06的生理生化特征。
[0023] 測定結(jié)果顯示，該菌株菌株革蘭氏陽性，接觸酶陽性，氧化酶陰性，VP試驗陽性，甲 基紅試驗陽性。該菌可利用葡萄糖、檸檬酸鹽；不利用木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇。所述降 解菌LGY06的生理生化特征測定結(jié)果如表2所示。
[0024] (3)降解菌16S rDNA的同源性分析 DNA測序由中國科學院微生物研究所完成，測序結(jié)果用Blast軟件Genbank中的16S rDNA序列進行同源性比較。
[0025] 獲得的 LGY06 的 16S rDNA 序列（SEQ ID NO. 1)如下： 該菌株的16S rDNA rDNA序列已經(jīng)提交到GenBank數(shù)據(jù)庫（GenBank登錄號： JN052922)，發(fā)現(xiàn)該序列與cerei/6· FR846528等菌株的基因序列同源性達99%。
[0026] 3)生長特性分析 進行了菌株最適溫度和最適PH生長實驗。采用無機鹽培養(yǎng)基，分別在20°C、25°C、 30 °C、35 °C和40 °C培養(yǎng)、觀察、記錄菌株的溫度適應(yīng)性，每個處理3次重復(fù)。調(diào)整酸度分別為 pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9,每個處理3次重復(fù)，培養(yǎng)、觀察、記錄菌株生長的最適pH。結(jié) 果表明，所述降解菌LGY06的最適生長溫度為30~35°C，最適生長pH為6~7。
[0027] 鑒于上述菌株LGY06的形態(tài)、生理生化特性和16S rDNA序列分析結(jié)果，將降解菌 LGY06鑒定為錯狀芽抱桿菌CfeciUiA? cereiAS1)。錯狀芽抱桿菌CfeciUiA? cereiAS1) LGY06 于2015年6月19日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，地址為中國武漢，武漢大學， 保藏號為 CCTCC M 2015398。
[0028] 本發(fā)明的實施例2 :降解敵草胺制劑的制備： 包括如下步驟： 1)將錯狀芽孢桿菌LGY06的菌株于無機鹽培養(yǎng)基中，30~35°C，150~200 rpm下振 蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，獲得菌種； 2) 將上述菌種按無機鹽培養(yǎng)基的體積比的10%的接種量接種入種子瓶，30~35°C， 150~200 rpm下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，獲得種子液； 3) 將獲得的種子液按照10%的體積比的接種量接種入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30~35°C、 150~200 rpm下發(fā)酵培養(yǎng)45-50h，獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液的菌數(shù)大于3. 0 X IO9 cfu/mL，將發(fā) 酵液直接稀釋為液體菌劑，液體菌劑中的菌數(shù)為2. 54 X 10s cfu/mL。
[0029] 本發(fā)明的實施例3 :降解菌LGY06對敵草胺的降解效能 在無機鹽培養(yǎng)基（同實施例1)中加入敵草胺，使其終濃度為50. 0 mg/L ;接種濃度為 2. 54X108 cfu/mL的菌劑，并設(shè)不接菌的培養(yǎng)基為對照，30°C (150 rpm)黑暗培養(yǎng)0~7d，定 期取樣。應(yīng)用HPLC法測定敵草胺的殘留量并計算降解率，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明，降 解菌LGY06在短時間內(nèi)可有效降解嘧菌酯，5 d內(nèi)對50. 0 mg/L敵草胺的降解率分別達到 66. 39%，7 d內(nèi)對50. 0 mg/L敵草胺的降解率分別達到76. 81%，具有較好的生物降解效果。 在不加菌的對照中，敵草胺的降解率均小于7%。試驗結(jié)果表明，降解菌LGY06對50. 0 mg/L 的敵草胺具有很好的降解能力。這一結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的降解菌LGY06可高效降解 敵草胺，在修復(fù)敵草胺污染的水體和土壤方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0030] 上述實施例中使用的培養(yǎng)基如下： 無機鹽培養(yǎng)基=KH2PO4 0· 4 g，K2HPO4 0· 4 g，NH4Cl I g，MgCl2 0· I g，Na2SO4 1. 425 g， FeSO4 · 7H20 0. 025 g，微量元素液10. 0 mL，加蒸餾水定容至1000 mL，pH 7. 0,高壓蒸汽滅 菌（121°C，20 min)。其中微量元素液組成如下：ZnSO4 ·7Η20 LI g，MgSO4. H2O 0.58 g， (NH4)6Mo7O24 · 4H20 0· 18 g，CoSO4 · 7H20 0· 024 g，CuSO4 · 5H20 0· 077 g，H3BO3 0· 029 g， NaNO3 · 4H20 0· 074 g，蒸餾水 I L。
[0031] 分離培養(yǎng)基：無機鹽培養(yǎng)基中按實驗設(shè)計要求添加不同濃度敵草胺唯一碳源，pH 7.0 (固體培養(yǎng)基添加20 g瓊脂)。
[0032] 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蛋白胨10.0 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂 20.0 g，pH7.0。
[0033] 以上培養(yǎng)基均在高壓鍋中121°C滅菌20~30分鐘。培養(yǎng)基中，30~35°C，150~ 200 rpm下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，獲得菌種。
【主權(quán)項】
1. 一種高效降解敵草胺的蠟狀芽孢桿菌LGY06,其特征在于：其保藏號為CCTCC NO :M 2015398。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效降解敵草胺的蠟狀芽孢桿菌LGY06,其特征在于：該菌株 16S rDNA 序列如 SEQ ID NO. 1 所示。3. -種如權(quán)利要求1所述的菌株在降解敵草胺殘留中的應(yīng)用。4. 一種采用如權(quán)利要求1所述的菌株生產(chǎn)降解敵草胺制劑的方法，其特征在于：將蠟 狀芽孢桿菌LGY06的菌株作為活性成分，制備獲得降解敵草胺的菌劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效降解敵草胺的蠟狀芽孢桿菌LGY06及其應(yīng)用及使用方法，所述菌株已于2015年6月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號是CCTCC？NO：M？2015398。本發(fā)明提供的蠟狀芽孢桿菌(<i>Bacillus？cereus</i>)LGY06在無機鹽培養(yǎng)基中7d對敵草胺(50.0mg/L)的降解率達到76.81%，這表明該菌株能夠高效降解敵草胺，可有效修復(fù)敵草胺污染的土壤和水體，解決農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中農(nóng)藥殘留超標問題及環(huán)境污染問題，保護生態(tài)環(huán)境和人類健康。CCTCCNO: M 201539820150619
【IPC分類】B09C1/10, C02F3/34, C02F101/38, C12N1/20, C12R1/085
【公開號】CN105018396
【申請?zhí)枴緾N201510509762
【發(fā)明人】吳小毛, 李明, 龍友華, 尹顯慧, 李榮玉, 張承
【申請人】貴州大學
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年8月19日