培養(yǎng)基成分為：蔗糖25g，（NH4) 2SO4 2g，KH2PO4 2g，MgSO4 · 7H20 lg，酵母粉 10g，玉米漿 lmL，F(xiàn)eSO4 · 7H20 2. 8mg，MnSO4 · H2O 2. 8mg，用去離子水定容到1L。
[0044] 優(yōu)選的，上述四氫嘧啶的制備方法，所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：葡萄糖20_40g， (NH 4) 2S04l-5g，KH2P04l-5g，MgSO 4 · 7H20 0· 2-2g，酵母粉 0· 1-lg，玉米漿 l-5mL，F(xiàn)eSO4 · 7H20 50-200mg，MnSO4 · H2O 50-200mg，用去離子水定容到 1L。
[0045] 優(yōu)選的，上述四氫嘧啶的制備方法，所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：葡萄糖40g， (NH4) 2SO4L 8g，KH2P043g，MgSO4 · 7H20 2g，酵母粉 0· lg，玉米漿 2mL，F(xiàn)eSO4 · 7H20 80mg， MnSO4 · H2O 80mg，用去離子水定容到1L。
[0046] 上述培養(yǎng)基均可采用標(biāo)準(zhǔn)方法制備獲得。
[0047] 本發(fā)明的有益效果是：
[0048] 上述產(chǎn)生四氫嘧啶的基因工程菌是通過合理的基因工程手段構(gòu)建出的一株以葡 萄糖為底物直接發(fā)酵生產(chǎn)四氫嘧啶的工程菌株，在不需要高鹽濃度的常規(guī)發(fā)酵條件下， 24-28h發(fā)酵液中能夠大量積累四氫嘧啶，經(jīng)檢測它們的產(chǎn)率均比現(xiàn)有工藝有所提升；整個 發(fā)酵過程控制與現(xiàn)有的發(fā)酵法和酶催化法生產(chǎn)四氫嘧啶鹽工藝相比，原料成本較低，培養(yǎng) 條件簡單，設(shè)備損耗小，發(fā)酵周期短，操作簡便，無需收集菌體提取酶液，四氫嘧啶生產(chǎn)效率 較高。
【附圖說明】
[0049] 圖1為菌株代謝改造圖；
[0050] 圖2為四氫嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜峰圖；
[0051] 圖3為四氫嘧啶發(fā)酵液的液相色譜峰圖。
【具體實(shí)施方式】
[0052] 為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】 對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0053] 實(shí)施例1
[0054] 產(chǎn)生四氫嘧啶的基因工程菌E. coli ECT06的構(gòu)建
[0055] (I) L-天冬氨酸-β -半醛到四氫嘧啶的代謝途徑的構(gòu)建。
[0056] ①采用PCR技術(shù)以伸長鹽單胞菌（CGMCC 1. 6329)基因組為模板，根據(jù)ectABC基 因序列設(shè)計一對引物，擴(kuò)增獲取ectABC片段。所述一對引物分別包含酶切位點(diǎn)EcoR I和 BamH 1〇
[0057] ②使用Takara限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切步驟①中獲得目的片段及 pTrc99a載體質(zhì)粒，獲得帶有相同粘性末端的ectABC和pTrc99a線性片段。
[0058] ③使用Takara T4DNA連接酶連接步驟②中獲得的兩個目的片段，得到目的載體 pTrc99a-ectABC〇
[0059] ④將步驟③中獲得的載體轉(zhuǎn)化入E. coli W3110 (ATCC 27325)中，獲得 E. coliECTOl
[0060] ⑵thrA基因的敲除
[0061] ①采用Red同源重組技術(shù)敲除上述基因。采用PCR技術(shù)以E. coli W3110(ATCC 27325)基因組為模板，根據(jù)thrA基因序列，在基因兩端設(shè)計同源臂引物，擴(kuò)增獲取thrA基 因的上下游同源臂。
[0062] ②采用PCR技術(shù)以pKD3為模板，設(shè)計引物，擴(kuò)增氯霉素抗性基因片段。
[0063] ③以步驟①和步驟②中獲得的擴(kuò)增片段為模板，通過重疊 PCR技術(shù)獲得thrA基因 敲除片段。所述基因敲除片段由thrA基因上下游同源臂基因片段及氯霉素抗性基因片段 組成。
[0064] ④將上述基因敲除片段導(dǎo)入含有pKD46質(zhì)粒的E. coli ECTOl中獲得陽性轉(zhuǎn)化子， 消除陽性轉(zhuǎn)化子中的氯霉素抗性基因后獲得thrA基因敲除菌E. coliECT02。
[0065] (3) IysA基因的敲除
[0066] 以步驟（2)中的方法敲除IysA基因，獲得陽性轉(zhuǎn)化子并消除氯霉素抗性基因后獲 得thrA和IysA基因敲除菌E. coliECT03
[0067] (4)iclR基因的敲除
[0068] 以步驟（2)中的方法敲除iclR基因，獲得陽性轉(zhuǎn)化子并消除氯霉素抗性基因后獲 得 thrA、lysA、iclR 基因敲除菌 E. coli ECT04。
[0069] (5)谷氨酸棒狀桿菌IysC基因的引入
[0070] ①采用PCR技術(shù)以谷氨酸棒狀桿菌（ATCC13032)基因組為模板，根據(jù)IysC基因序 列設(shè)計一對引物擴(kuò)增IysC基因片段；
[0071] ②采用PCR技術(shù)擴(kuò)增pSTV28上的Iac啟動子；
[0072] ③采用PCR技術(shù)擴(kuò)增pKD3上的氯霉素抗性片段；
[0073] ④采用PCR技術(shù)以E. coli W3110(ATCC27325)基因組為模板，根據(jù)arsB基因序列 設(shè)計同源臂引物，上下游同源臂均位于arsB基因內(nèi)部；
[0074] ⑤以步驟①、②、③、④獲得的擴(kuò)增片段為模板通過重疊 PCR獲得IysC整合片段， 所述片段由arsB基因上游同源臂、arsB基因下游同源臂、Iac啟動子片段、氯霉素抗性基因 片段、IysC基因片段組成；
[0075] ⑥將上述基因片段導(dǎo)入含有PKD46的E. coli ECT04中，獲得陽性轉(zhuǎn)化子，消除轉(zhuǎn) 化子中的氯霉素抗性基因后獲得arsB基因替換為Iac啟動子控制的IysC基因的E. coli ECT05。
[0076] (6)ppc基因啟動子的替換
[0077] ①采用PCR技術(shù)以E. coli W3110(ATCC 27325)基因組為模板，根據(jù)ppc基因序列 設(shè)計同源臂引物，上游同源臂位于PPC啟動子上游，下游同源臂位于PPC結(jié)構(gòu)基因前600bp 范圍內(nèi)；
[0078] ②采用PCR技術(shù)擴(kuò)增pTrc99a載體質(zhì)粒上的trc啟動子；
[0079] ③采用PCR技術(shù)擴(kuò)增pKD3質(zhì)粒上的氯霉素抗性片段；
[0080] ④以步驟①、②、③獲得的擴(kuò)增片段為模板通過重疊 PCR獲得ppc啟動子替換片 段，所述片段由PPC基因啟動子上游同源臂、PPC基因下游同源臂、trc啟動子片段、氯霉素 抗性基因片段組成；
[0081] ⑤將上述基因片段導(dǎo)入含有PKD46的E. coli ECT05中，獲得陽性轉(zhuǎn)化子，消除轉(zhuǎn) 化子中的氯霉素抗性基因后獲得ppc啟動子替換為trc啟動子的E. coli ECT06。
[0082] 可見，本發(fā)明所述產(chǎn)生四氫嘧啶的基因工程菌：
[0083] 1)敲除編碼高絲氨酸脫氫酶I和二氨基更二酸脫羧酶的基因 thrA和lysA，削弱 了 L-天冬氨酸-β -半醛到賴氨酸和蘇氨酸的代謝。
[0084] 2)E. coliW3110中thrA基因同時編碼天冬氨酸激酶，thrA的敲除會導(dǎo)致天冬氨酸 到L-天冬氨酸-β -半醛的合成受阻，因此在基因組整合來自谷氨酸棒狀桿菌的天冬氨酸 激酶編碼基因 lysC，保證L-天冬氨酸-β -半醛的充分合成。
[0085] 3)將磷酸烯醇式丙酮酸激酶編碼基因的ppc啟動子替換為trc啟動子，并敲除乙 醛酸循環(huán)控制基因 iclR以打開乙醛酸循環(huán)，增強(qiáng)了葡萄糖到L-天冬氨酸的代謝通量。
[0086] 通過上述一系列的改造增強(qiáng)了葡萄糖到L-天冬氨酸_β -半醛的代謝通量，減弱 了 L-天冬氨酸-β -半醛的支路代謝，使得工程菌可以直接利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)四氫嘧啶， 發(fā)酵28h后四氫嘧啶的產(chǎn)量達(dá)到了 18g/L，具體生產(chǎn)四氫嘧啶的方法見實(shí)施例2。
[0087] 實(shí)施例2
[0088] 產(chǎn)生四氫嘧啶的基因工程菌E. C〇liECT06的發(fā)酵培養(yǎng)及檢測，具體步驟如下：
[0089] (1)使用細(xì)菌完全培養(yǎng)基活化產(chǎn)生四氫嘧啶的基因工程菌（E. coli ECT06工程 菌），37°C恒溫培養(yǎng)12h ;
[0090] (2)將上述活化斜面轉(zhuǎn)接二代活化斜面，37°C恒溫培養(yǎng)IOh ;
[0091] (3)使用接種環(huán)刮取一環(huán)菌種到裝液量為30mL的500mL圓底三角瓶中，37°C， 200rpm 培養(yǎng) 7h ;
[0092] (4)使用移液管按照10%接種量接種發(fā)酵搖瓶，發(fā)酵瓶為裝液量為30mL的500mL 擋板三角瓶，37°C，200rpm培養(yǎng)28h ;苯酚紅作為指示劑，通過微量進(jìn)樣器補(bǔ)加氨水維持pH 在7. 2,補(bǔ)加3mL，60% (m/v)葡萄糖溶液維持發(fā)酵進(jìn)行，發(fā)酵周期24h ;
[0093] (5)收集發(fā)酵液，13000rmp離心，收集上清液相檢測四氫嘧啶含量；
[0094] (6)使用去離子水將上清稀釋200倍，經(jīng)0. 22 μ m微孔過濾膜過濾后待測；
[0095] (7)使用UltiMate 3000 (Thermo Scientific)高