一種誘導(dǎo)三孢布拉氏霉老化菌株快速大量產(chǎn)孢的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種誘導(dǎo)三孢布拉氏霉老化菌株快速大量產(chǎn)孢的方法及所得孢子在三孢布拉氏霉菌株分離和選育上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]番茄紅素是一種脂溶性類胡蘿卜素，具有良好的抗氧化、抗腫瘤功效，且對腫瘤的預(yù)防、心血管的保護(hù)、維持免疫細(xì)胞的完整性有一定作用，因此備受眾多研究者關(guān)注。番茄紅素的主要獲取方式有提取法、化學(xué)合成法和生物合成法。其中生物合成法是一種最有前景的獲取番茄紅素的方式，三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素具有發(fā)酵單位效價(jià)高、環(huán)境友好、綠色天然、生產(chǎn)不受季節(jié)影響等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)番茄素。但三孢布拉霉菌存在老化速度快、優(yōu)良生產(chǎn)性狀易丟失、保存菌株性狀難恢復(fù)等缺點(diǎn)給工業(yè)化生產(chǎn)帶來困難，發(fā)酵生產(chǎn)中需要不斷地對菌株持續(xù)進(jìn)行優(yōu)化選育。
[0003]三孢布拉霉菌菌絲為一種多核無橫隔菌絲，其存在的等位基因可掩蓋基因的正突變，故以單核孢子懸液為載體的選育方式成為最佳選擇。三孢布拉霉菌(尤其是負(fù)菌)老化速度較快，菌絲老化后，其生命力衰退，色素分泌增加，細(xì)胞中空泡增多，甚至破裂。老化的菌種接入培養(yǎng)料后表現(xiàn)為菌絲生長慢、抵抗雜菌能力弱、產(chǎn)孢能力降低，給菌種的分離純化和優(yōu)化選育帶來困難，因此迫切需要掌握三孢布拉霉菌老化菌株的大量產(chǎn)孢技術(shù)。
[0004]華中科技大學(xué)張陽(三孢布拉霉大量產(chǎn)孢條件及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究，2013，8-21.)在250 ml的錐形瓶中分裝60 ml的PDA培養(yǎng)基，以孢子懸液的方式接種，每個(gè)錐形瓶的接種量為I ml，接種后置于28°C恒溫?fù)u床靜置培養(yǎng)20-24 h，然后置于20°C恒溫?fù)u床靜置培養(yǎng)6 d，整個(gè)培養(yǎng)過程歷時(shí)7d，培養(yǎng)時(shí)間過長，不適于工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)三孢布拉霉正、負(fù)菌的老化菌株快速大量產(chǎn)生孢子的方法，為三孢布拉霉菌菌種的優(yōu)化選育提供簡便而必備的前提條件。
[0006]本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
本發(fā)明所采用菌種，三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trisporazustl+)、三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trisporazustl-)(浙江匯能動(dòng)物藥品有限公司微生物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室保藏)，該菌種具有代表性。
[0007]具體操作方法為:
(I)在培養(yǎng)皿中裝入半固體培養(yǎng)基，將三孢布拉霉菌老化菌株的菌絲接種于半固體培養(yǎng)基中，在相對濕度為80-95%、空氣流量為0.5 L/min的黑暗環(huán)境中，先于25_30°C下培養(yǎng)24-48h，再于10-20°C下培養(yǎng)12-24 h，培養(yǎng)基平板上長出孢子或菌絲；三孢布拉霉菌的接種方式有菌餅、菌絲體、孢子液三種方式，采用菌餅的接種方式，產(chǎn)孢量較低，菌絲體的接種方式產(chǎn)孢量高且操作簡便。水分是控制三孢布拉霉孢囊孢子萌發(fā)的關(guān)鍵因素，濕度越大越有利于孢囊孢子的萌發(fā)；當(dāng)濕度超過95%時(shí)，染菌幾率增高，同時(shí)因細(xì)胞滲透壓的影響，孢子反而不易形成。由于生物的應(yīng)激效應(yīng)，高溫轉(zhuǎn)低溫的培養(yǎng)方法更有利于孢子的產(chǎn)生。三孢布拉氏霉菌是好氧微生物，氧氣供應(yīng)充足可以提高細(xì)胞的生長。然而，三孢布拉霉交織生長的菌絲使氧氣在培養(yǎng)基中的含量降低，因此培養(yǎng)過程中要保持一定的空氣流量，同時(shí)采用培養(yǎng)皿作為三孢布拉霉菌的培養(yǎng)器皿，相比三角瓶，可以增加三孢布拉霉菌與氧氣的接觸面積，增大其產(chǎn)孢量。
[0008](2)將所得孢子或菌絲收集劃線于另一新半固體培養(yǎng)基平板上，在步驟(I)所述環(huán)境參數(shù)下培養(yǎng)；
(3)重復(fù)步驟(2)所述操作，培養(yǎng)1-5代菌絲，挑取或收集孢子，即可得到大量孢子，即可得到大量孢子，菌絲的培養(yǎng)代次數(shù)量與菌株老化程度有關(guān)。
[0009]步驟(I)中所述半固體培養(yǎng)基配方為:麥芽浸膏5-40 g/L，酵母蛋白胨5-20g/L，小分子羧酸鹽 1-20 g/L, CuSO4.5H20 1-10 mg/L，F(xiàn)eCl3.6H20 10-500 mg/L，Co (NO3)2.6H20 l-10mg/L，瓊脂粉15_20g/L，所述培養(yǎng)基的pH為5.5-7.5。蛋白胨富含有機(jī)氮化合物，能為微生物提供C源、N源、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)。小分子羧酸鹽可以為三孢布拉霉菌提供氮源，用于形成孢子的結(jié)構(gòu)蛋白和mRNA分鐘以及孢子形成所需的一些相關(guān)酶，其適當(dāng)?shù)挠昧靠梢哉T導(dǎo)三孢布拉霉子囊孢子產(chǎn)生，但是過量的小分子羧酸鹽和蛋白胨反而會(huì)抑制三孢布拉霉子囊孢子的產(chǎn)生。CuSO4.5H20可以作為一些酶類的激活劑，在其適當(dāng)濃度時(shí)可能對三孢布拉霉菌株產(chǎn)孢過程的相關(guān)酶有激活作用，從而促進(jìn)菌株產(chǎn)孢，但當(dāng)CuSO4.5H20用量較大時(shí)，反而會(huì)導(dǎo)致菌株產(chǎn)孢量降低。FeCl3.6H20和Co (NO3)2.6H20均為三孢布拉霉孢子的形成提供了微量元素，其用量適當(dāng)時(shí)對孢布拉霉菌株產(chǎn)孢有明顯促進(jìn)作用，當(dāng)超過最佳用量時(shí)，菌株產(chǎn)孢量反而會(huì)下降。三孢布拉霉菌株的產(chǎn)孢需要適宜的PH條件，偏酸或者偏堿性的培養(yǎng)基均會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)孢量降低，對菌株的代謝活動(dòng)產(chǎn)生影響。
[0010]作為優(yōu)選，步驟(I)所述相對濕度為85%，培養(yǎng)時(shí)間為:先于27°C下培養(yǎng)44 h，再于15°C培養(yǎng)16 h。
[0011]作為優(yōu)選，所述半固體培養(yǎng)基配方為:麥芽浸膏20 g/L，酵母蛋白胨10g/L，小分子羧酸鹽 3 g/L, CuSO4.5H20 7 mg/L, FeCl3.6H20 250 mg/L, Co (NO3) 2.6H20 4 mg/L,瓊脂粉18g/L，所述培養(yǎng)基的pH為7。
[0012]作為優(yōu)選，步驟(I)中所述平板培養(yǎng)基厚度為1.5-1.9_。
[0013]作為優(yōu)選，所述小分子羧酸鹽為丙酸鹽、乙酸鹽或乳酸鹽中的一種。
[0014]本發(fā)明還涉及老化菌株所產(chǎn)孢子在菌株分離純化及菌種選育方面的應(yīng)用，具體操作方法為:在無菌條件下，將所得孢子和菌絲混合物用無菌生理鹽水沖洗并收集，再采用4層擦鏡紙過濾，將濾液收集于三角瓶中，稀釋得孢子懸液，將濃度為15-1O6個(gè)/mL的孢子懸液用于誘變處理，將濃度為16-1O8個(gè)/mL的孢子懸液平板涂布，用于菌種的分離純化。
[0015]本發(fā)明的有益效果為:
1、本發(fā)明所采用的培養(yǎng)基配方簡單、原料廉價(jià)易得，對菌株培養(yǎng)環(huán)境要求簡單、常規(guī)，易于操作控制，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0016]2、產(chǎn)孢量多、產(chǎn)孢速度快，有效解決了三孢布拉霉菌(尤其是負(fù)菌)培養(yǎng)過程中不產(chǎn)或少產(chǎn)孢子的問題。
[0017]3、所生產(chǎn)孢子可用于三孢布拉霉菌菌株的分離純化和菌種優(yōu)化選育，對接種方式優(yōu)化、單位效價(jià)提高、防止菌株過快老化等具有重要意義。
[0018]說明書附圖
圖1為產(chǎn)孢前的負(fù)菌孢子；
圖2為產(chǎn)孢后的負(fù)菌孢子；
圖3為產(chǎn)孢前的正菌孢子；
圖4為產(chǎn)孢后的正菌孢子。
具體實(shí)施例
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明不受實(shí)施例限制。
[0020]實(shí)施例1:三孢布拉霉菌老化菌株產(chǎn)生大量孢子
(I)按如下配方配制半固體培養(yǎng)基:麥芽浸膏20g/L，酵母蛋白胨10g/L，丙酸鹽3g/L，CuSO4 ■ 5H20 7 m