取代galk標記。 0RF48 FKBP Fw ：gttgttgtgtcacgataattcagaaatacgctcggatcaccctttatttat ATGGGAGTGCAGGTGGAAACC Rv ：tttttggctggctgggggcttatgtcgatcctatccaatcccgatcgtgc TTCCGGTTTTAGAAGCTCCAC 8) 如7)項所述的開放讀碼框4及48同時都帶有ddFKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹 病毒是ddFKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹病毒。檢測0RF4及48同時都帶有ddFKBP標記 的重組水痘-帶狀皰疹病毒的引物： 0RF4 check Fw ：ggaagatacaggcaactgca Rv ：gtcttcacaaatagtagaca 0RF48 check Fw ：gcactcaaagcttttcgaag Rv ：acaaaagggtgctgtagacc
[0010] 本發(fā)明的效果
[0011] 如8)項所述的開放讀碼框4及48同時帶有ddFKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹 病毒，其中，帶有雙重標記的重組病毒在哺乳動物細胞中進行增殖時受到Shieldl的調(diào)節(jié) 作用。
[0012] 如[0011]項所述的開放讀碼框4及48分別帶有ddFKBP標記的重組水痘-帶狀皰 疹病毒，其中，帶有雙重標記的重組病毒在哺乳動物細胞中進行增殖時，有Shieldl存在， 病毒就復(fù)制生長。
[0013] 如[0011]項所述的開放讀碼框4及48分別帶有ddFKBP標記的重組水痘-帶狀 皰疹病毒，其中，帶有雙重標記的重組病毒在哺乳動物細胞中進行增殖時，沒有Shieldl存 在，病毒就不能復(fù)制生長。
【附圖說明】
[0014] 圖1顯示重組水痘-帶狀皰疹病毒基因4與48分別被ddFKBP標記后PCR檢測結(jié) 果的瓊脂糖凝膠電泳圖
[0015] 圖2顯示有Shieldl存在時，ddFKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹病毒在哺乳動物 細胞中增殖圖
[0016] 圖3顯示沒有Shieldl存在時，ddFKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹病毒在哺乳動 物細胞中增殖圖
【具體實施方式】
[0017] 下面的實施例中將對本發(fā)明作進一步的闡述，但本發(fā)明不限于此
[0018] 水痘-帶狀皰疹病毒的基因4和基因48分別是病毒增殖所必需的基因，分別位于 水痕病毒基因組（Human herpesvirus 3，complete genome，NCBI Reference Sequence : NC_001348. I)中堿基的 4138 與 4139 及 84669-84670 之間插入 ddFKBP 片段 MGVQVETISP⑶ GRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHP GIIPPHATLVFDVELLKPE ；
[0019] 實施例一：將6. 0 μ g基因4及基因48同時被ddFKBP標記的重組水痘-帶狀皰 疹病毒BAC DNA用無血清的細胞培養(yǎng)液稀釋至200 μ 1，同時將轉(zhuǎn)染試劑24 μ 1用無血清的 細胞培養(yǎng)液稀稀釋至400 μ 1 ;然后，將稀釋的DNA與轉(zhuǎn)染試劑輕輕混合均勻，室溫放置20 分鐘后，添加到匯合度為60%的急性視網(wǎng)膜色素上皮-19細胞（acute retinal pegment epitheliitis-19, ARPE-19)的4孔培養(yǎng)板，每孔分別加150μ1，其中，兩孔分別添加 ΙμL shieldl ;另兩孔不加 shieldl，16小時后，更換培養(yǎng)液（添加 shieldl的孔分別繼續(xù)添加 1 μ I shieldl)繼續(xù)培養(yǎng)；七天后發(fā)現(xiàn)添加 shieldl的兩孔有重組病毒的復(fù)制生長，而沒有 添加 shieldl的兩孔都沒有重組病毒的復(fù)制生長。
[0020] 實施例二：將6. 0 μ g基因4及基因48同時被ddFKBP標記的重組水痘-帶狀皰 疹病毒BAC DNA用無血清的細胞培養(yǎng)液稀釋至200 μ 1，同時將轉(zhuǎn)染試劑24 μ 1用無血清的 細胞培養(yǎng)液稀稀釋至400 μ 1 ;然后，將稀釋的DNA與轉(zhuǎn)染試劑輕輕混合均勻，室溫放置20 分鐘后，添加到匯合度為60%的人胚胎成纖維細胞（human embryo fibroblasts cell-5， MRC-5)的4孔培養(yǎng)板，每孔分別加150 μ 1，其中，兩孔分別添加 I μ I shieldl ;另兩孔不加 shieldl，16小時后，更換培養(yǎng)液（添加 shieldl的孔分別繼續(xù)添加1 μ I shieldl)繼續(xù)培 養(yǎng)；七天后發(fā)現(xiàn)添加 shieldl的兩孔有重組病毒的復(fù)制生長，而沒有添加 shieldl的兩孔都 沒有重組病毒的復(fù)制生長。
[0021] 實施例三：將6. 0 μ g基因4及基因48同時被ddFKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹 病毒BAC DNA用無血清的細胞培養(yǎng)液稀釋至200 μ 1，同時將轉(zhuǎn)染試劑24 μ 1用無血清的細 胞培養(yǎng)液稀稀釋至400 μ 1 ;然后，將稀釋的DNA與轉(zhuǎn)染試劑輕輕混合均勻，室溫放置20分 鐘后，添加到匯合度為60%的人惡性黑素瘤細胞系（human skin melanoma calls，MeWo)的 4孔培養(yǎng)板，每孔分別加150 μ 1，其中，兩孔分別添加 I μ I shieldl ;另兩孔不加 shieldl， 16小時后，更換培養(yǎng)液（添加 shieldl的孔分別繼續(xù)添加1 μ I shieldl)繼續(xù)培養(yǎng)；七天 后發(fā)現(xiàn)添加 shieldl的兩孔有重組病毒的復(fù)制生長，而沒有添加 shieldl的兩孔都沒有重 組病毒的復(fù)制生長。
[0022] 實施例四：將6. 0 μ g基因4及基因48同時被ddFKBP標記的重組水痘-帶狀皰 疹病毒BAC DNA用無血清的細胞培養(yǎng)液稀釋至200 μ 1，同時將轉(zhuǎn)染試劑24 μ 1用無血清的 細胞培養(yǎng)液稀稀釋至400 μ 1 ;然后，將稀釋的DNA與轉(zhuǎn)染試劑輕輕混合均勻，室溫放置20 分鐘后，添加到匯合度為60%的人胚腎細胞系（Human Embryonic Kidney 293cells，HEK 293)的4孔培養(yǎng)板，每孔分別加150 μL，其中，兩孔分別添加 I μL shieldl ;另兩孔不加 shieldl，16小時后，更換培養(yǎng)液（添加 shieldl的孔分別繼續(xù)添加1 μ I shieldl)繼續(xù)培 養(yǎng)；七天后發(fā)現(xiàn)添加 shieldl的兩孔有重組病毒的復(fù)制生長，而沒有添加 shieldl的兩孔都 沒有重組病毒的復(fù)制生長。
[0023] 上述對實施例的描述是為了便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和應(yīng)用本發(fā) 明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的 一般原理應(yīng)用到其他實施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于這里的實施 例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進和修改都應(yīng)該在 本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. ddFKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹病毒。 2. ddFKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹病毒，其特征在于：利用細菌人工染色體 (Bacterial Artificial Chromosome，BAC)能夠克隆大段DNA病毒的特點，依據(jù)同源重組 (homologous recombination)的原理，將水痕帶狀皰疼病毒（Varicella-zoster virus， VZV)，開放閱讀框（open reading frame，ORF)0RF4和48,用一個高度不穩(wěn)定域FKBP12 蛋白質(zhì)(the destabilization domain of a highly unstable variant of the human FKBP12protein，ddFKBP)標記。ddFKBP標記蛋白可以被蛋白酶迅速降解。但其合成配體 (A synthetic ligand，shieldl)可以與不穩(wěn)定域ddFKBP進行結(jié)合，阻止其降解，允許積累 標記蛋白。3. 權(quán)利要求2所述的ddFKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹病毒，其特征包括以下幾個步 驟： 1) 同時帶有g(shù)alk標記的VZV 0RF4和48細菌人工染色體，在以半乳糖為唯一碳源的培 養(yǎng)板上，通過氯霉素抗性及galk選擇可以得到galk標記的VZV 0RF4和48細菌人工染色 體。 2) 同時帶有ddFKBP標記的VZV 0RF4和48細菌人工染色體，在含有2-脫氧-半乳糖 培養(yǎng)基的培養(yǎng)板上，通過氯霉素抗性基因篩選可獲得VZV 0RF4和48的ddFKBP標記的細菌 人工染色體。 3) 在哺乳動物細胞中，培養(yǎng)0RF4和48同時被ddFKBP標記的病毒，沒有shieldl存在 時，病毒不能復(fù)制；有Shieldl存在時，病毒能夠進行復(fù)制。
【專利摘要】FKBP標記的重組水痘-帶狀皰疹病毒。為獲得有效高滴度水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)疫苗，構(gòu)建了水痘帶狀皰疹病毒開放閱讀框4和48帶有FKBP標記的病毒(VZV？ORF4-48-FKBP)。用VZV？ORF4-48-FKBP轉(zhuǎn)染ARPE-19細胞后，當細胞培養(yǎng)液中，加FKBP合成配體(shield1)時，VZV？ORF4-48-FKBP能夠進行復(fù)制積累；如果細胞培養(yǎng)液中不加Shield1，病毒不能復(fù)制。表明Shield1可以調(diào)節(jié)帶有FKBP標記病毒的復(fù)制。
【IPC分類】C12N7/01, C12R1/93, C12N15/12, C12N15/85
【公開號】CN105018434
【申請?zhí)枴緾N201510032402
【發(fā)明人】李淑英, 張科, 劉占軍, 杜軍, 李娟 , 朱麗華, 李冀, 劉愛華
【申請人】河北聯(lián)合大學(xué)
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年1月16日