一種兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多 克隆抗體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗原通常是由多個(gè)抗原決定簇組成的，由一種抗原決定簇刺激機(jī)體，由一個(gè)B淋 巴細(xì)胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體稱之為單克隆抗體。由多種抗原決定簇刺激機(jī)體，相應(yīng)地 就產(chǎn)生各種各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體，機(jī)體內(nèi)所產(chǎn) 生的抗體就是多克隆抗體；除了抗原決定簇的多樣性以外，同樣一類抗原決定簇，也可刺激 機(jī)體產(chǎn)生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五類抗體。多克隆抗體是由異源抗原（大分子抗原、 半抗原偶聯(lián)物）刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，有機(jī)體漿細(xì)胞分泌的一組免疫球蛋白。多克隆抗 體由于其可識(shí)別多個(gè)抗原表位、可引起沉淀反應(yīng)，制備時(shí)間短，成本低的原因廣泛應(yīng)用于研 究和診斷方面。
[0003] 而泛素-蛋白酶體途徑廣泛存在于真核生物中，是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重 要途徑，并且在維持細(xì)胞功能以及細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)，抵御環(huán)境脅迫，胚胎發(fā)育，激素響應(yīng)和衰 老等方面發(fā)揮著重要的作用。泛素-蛋白酶體途徑中關(guān)鍵酶主要包括泛素活化酶（El)、泛 素結(jié)合酶（E2)與泛素連接酶（E3)，其中泛素結(jié)合酶（E2)蛋白在調(diào)控光形態(tài)建成、維管束發(fā) 育、脅迫響應(yīng)和抗逆脅迫響應(yīng)等方面具有重要作用。
[0004] 在萌蘆科植物領(lǐng)域內(nèi)，泛素結(jié)合酶（E2)基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，泛素結(jié)合酶（E2) 基因以多拷貝基因的形式存在，進(jìn)而造成泛素結(jié)合酶（E2)蛋白功能冗余，這是致使泛素結(jié) 合酶（E2)基因的研究進(jìn)展不大的主要原因。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的成熟，越來(lái)越多模式植 物的全基因組序列被完成，可以利用不同的模式植物來(lái)研究基因的功能，并基于其基因組 的差異來(lái)解決泛素結(jié)合酶（E2)功能容余性的問(wèn)題，以推動(dòng)泛素結(jié)合酶（E2)蛋白的功能研 究。
[0005] 多克隆抗體技術(shù)是研究蛋白質(zhì)功能和臨床檢測(cè)中重要的一環(huán)，但是目前現(xiàn)有技術(shù) 中，關(guān)于黃瓜泛素結(jié)合酶（E2)基因的研究尚未成熟，對(duì)于黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆 抗體也沒(méi)有出現(xiàn)相關(guān)報(bào)道，更沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)關(guān)于黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體的具 體制備方法，這些都限制了對(duì)黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白生物學(xué)功能的深入分析，缺少了基 于黃瓜矮化植株檢測(cè)、品種純度和分子生物學(xué)研究的物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。
[0006] 為填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體的空白，本發(fā)明提供 了一種兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體及其制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種特異性好、純度高、可與黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白發(fā) 生特異性結(jié)合反應(yīng)的兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體及其制備方法。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] -種用于制備兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體的黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2 蛋白，該蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] 本發(fā)明提供了一種兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體，是以氨基酸序列 如SEQ ID NO: 1所示的黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白作為免疫原，由兔子產(chǎn)生的多克隆抗體。
[0011] 本發(fā)明另一方面還提供了一種兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體的制備 方法，包括如下步驟：
[0012] 步驟1將粗提取的抗原黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白進(jìn)行純化；
[0013] 步驟2從兔子耳部靜脈抽取血清，作為陰性對(duì)照組血清；
[0014] 步驟3將純化后的黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白乳化，乳化后在兔子背部皮下多點(diǎn)注 射，先后注射四次，每次間隔7-10天；
[0015] 步驟4第四次注射10-12天后從兔子頸部動(dòng)脈取血，將所得血樣置于離心機(jī)中進(jìn) 行離心，收取離心后血清；
[0016] 步驟5將如氨基酸序列SEQ ID NO: 1所示的黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白與溴化氰 活化的Sepharose 4B偶聯(lián)，形成多肽親和層析柱；
[0017] 步驟6將步驟4中含有兔抗黃瓜CsE2蛋白抗體的血清加入到步驟5制備的多肽 親和層析柱中，放置于4°C孵育過(guò)夜后，洗脫抗體，即得到兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多 克隆抗體。
[0018] 進(jìn)一步地，步驟1中所述黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白的純化具體為，采用Protein G 親和柱對(duì)粗提取的抗原黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白進(jìn)行純化，使黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白 的純度到達(dá)95%以上。
[0019] 進(jìn)一步地，步驟4中離心的步驟具體為，將所得血樣置于離心機(jī)中，在5000RPM下 離心兩次，每次離心10min。
[0020] 進(jìn)一步地，步驟5中所述黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體的效價(jià)在1 : 102400 以上。
[0021] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體的效價(jià)通過(guò)ELISA法進(jìn) 行測(cè)定。
[0022] 本發(fā)明的兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體的制備后的應(yīng)用較為廣泛， 可與黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，可用于western-blot、免疫組化試驗(yàn) 的要求。
[0023] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0024] 本發(fā)明制備的兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體具有特異性好、純度高 的特點(diǎn)，可與細(xì)胞內(nèi)源性的黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，可用于免疫組 化、免疫印跡等實(shí)驗(yàn)的要求，用于建立體外免疫分析。本發(fā)明的兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2 蛋白多克隆抗體的制備，為深入研究黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白的生物學(xué)功能和黃瓜植株 矮化鑒定提供了一個(gè)重要的工具，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為本發(fā)明的兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體效價(jià)測(cè)定的結(jié)果圖；
[0026] 圖2為本發(fā)明的免疫雜交檢測(cè)兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體的特異 性結(jié)果圖；
[0027] 圖3為本發(fā)明的兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體的結(jié)構(gòu)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明 的【具體實(shí)施方式】做詳細(xì)的說(shuō)明。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 本發(fā)明實(shí)施例的一種用于制備兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體的黃瓜 泛素結(jié)合酶CsE2蛋白，該蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0031] 本發(fā)明的實(shí)施例提供了一種兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體，是以氨 基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白作為免疫原，由兔子產(chǎn)生的多克 隆抗體。兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體的結(jié)構(gòu)具體如圖3所示。
[0032] 本發(fā)明的實(shí)施例另一方面還提供了一種兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗 體的制備方法，包括如下步驟：
[0033] 步驟1將粗提取的抗原黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白進(jìn)行純化；
[0034] 步驟2從兔子耳部靜脈抽取血清，作為陰性對(duì)照組血清；
[0035] 步驟3將純化后的黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白乳化，乳化后在兔子背部皮下多點(diǎn)注 射，先后注射四次，每次間隔7-10天；
[0036] 步驟4第四次注射10-12天后從兔子頸部動(dòng)脈取血，將所得血樣置于離心機(jī)中進(jìn) 行離心，收取離心后血清；
[0037] 步驟5將如氨基酸序列SEQ ID NO: 1所示的黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白與溴化氰 活化的Sepharose 4B偶聯(lián)，形成多肽親和層析柱；
[0038] 步驟6將步驟4中含有兔抗黃瓜CsE2蛋白抗體的血清加入到步驟5制備的多肽 親和層析柱中，放置于4°C孵育過(guò)夜后，洗脫抗體，即得到兔抗黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多 克隆抗體。
[0039] 具體地，步驟1中所述黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白的純化具體為，采用Protein G 親和柱對(duì)粗提取的抗原黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白進(jìn)行純化，使黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白 的純度到達(dá)95%以上。
[0040] 步驟4中離心的步驟具體為，將所得血樣置于離心機(jī)中，在5000RPM下離心兩次， 每次離心10min。
[0041 ] 步驟6中的黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白多克隆抗體通過(guò)ELISA法測(cè)定的效價(jià)在1 : 102400 以上。
[0042] 實(shí)施例2
[0043] 一、抗原蛋白的純化及純度分析
[0044] 采用黃瓜莖尖對(duì)黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白進(jìn)行提取，然后通過(guò)純化與雙向電泳 獲得抗原蛋白的粗品，然后抗原蛋白粗品采用GE公司Protein G親和柱（HiTrap Protein G HP 17-0404-01)進(jìn)行純化及純度分析，使得黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白的純度達(dá)到95. 8%。
[0045] 二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫
[0046] 選取健康雄性家兔一只，從兔子耳部靜脈抽取陰性血清，作為對(duì)照組血清。選取步 驟一中提純后的黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白200 μ g，用200 μ L生理鹽水將其溶解稀釋，加入 等體積的弗氏佐劑將黃瓜泛素結(jié)合酶CsE2蛋白乳化（初次免疫用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫 用弗氏不完全佐劑）；用混勻儀器將溶液和佐劑混勻形成油包水，將混勻好的免疫原在兔 子背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行免疫，打8-10個(gè)點(diǎn)，先后注射四次，每次間隔7天。
[0047] 耳靜脈取陰性血：用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精擦拭兔子耳部靜脈，擦至靜脈充分?jǐn)U 張，用注射器插入靜脈抽取陰性血l_2mL，將所得血樣在室溫靜置30min后，置于離心機(jī)中， 在4°C下，5000RPM離心兩次，每次離心10min，然后收取血清。頸動(dòng)脈取陽(yáng)性血：首先用麻醉 劑麻醉兔子（戊巴比妥鈉，30mg/kg，靜脈、腹腔、肌肉注射均可），在兔子麻醉后，用固定架 固定，然后用手術(shù)器械剪開頸部外層皮毛，于氣管側(cè)面下方找到頸動(dòng)脈，止血鉗夾緊動(dòng)脈管 并剪斷放血并收集，將所得血樣在室溫靜置30min后，置于離心機(jī)中，在4°C下，5000RPM下 離心兩次，每次離心10min，然后收取血清。
[0048] 三、多克隆抗體的純化
[0049] 多肽親和層析柱的制備：取Ig CNBr活化的Sepharose 4B瓊脂糖凝膠珠，用 lmmol/L HCl 進(jìn)行預(yù)處理后，再用偶聯(lián)緩沖液（0. lmol/L NaHC03,0. 5m