一種利用菌株mqo-154制備精氨酸酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用菌株MQ0-154制備精氨酸酶的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鳥氨酸是1877年，杰弗在喂養(yǎng)安息香酸的鳥類尿液的水解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的，因此得 名。它是細(xì)菌細(xì)胞膜和多肽類抗生素的組成成分，可以作為氨基酸輸液原料。能促進(jìn)生長 激素的分泌，以協(xié)助機(jī)體代謝過多的脂肪，與精氨酸配合使用具有很好的減肥效果。在動物 體內(nèi)主要參與尿酸循環(huán)，對于體內(nèi)氨態(tài)氮的排出有重要作用。鳥氨酸是維持免疫系統(tǒng)和肝 功正常不可缺少的，能解毒氨及幫助肝再生，除在醫(yī)藥上作為試劑與注射液外，還通常與精 氨酸一起用作保肝、強(qiáng)身、解毒劑之類藥劑的原料。在皮膚和結(jié)締組織中含有高濃度的鳥氨 酸對于愈合和修復(fù)損傷組織非常有益。鳥氨酸是由體內(nèi)的精氨酸合成的，反過來，它又是瓜 氨酸、脯氨酸和谷氨酸的前體。鳥氨酸能將氨轉(zhuǎn)化為尿素與谷氨酰氨，因此補(bǔ)充鳥氨酸可為 解毒途徑提供酶的作用物。當(dāng)身體制造尿素，精氨酸便會被新陳代謝掉，身體轉(zhuǎn)為制造鳥氨 酸。用動物做的實驗證明鳥氨酸和精氨酸能令身體生產(chǎn)更多合成代謝的、促進(jìn)生長的荷爾 蒙，包括胰島素和生長荷爾蒙，來促進(jìn)肌肉生長。此外，鳥氨酸還用于配制恢復(fù)疲勞的發(fā)泡 飲料。
[0003] 在生物體內(nèi)，鳥氨酸能在尿素循環(huán)（Krebs. Henseleit循環(huán)）中起作用。尿素循 環(huán)分為4步，能夠?qū)⑸矬w內(nèi)天冬氨酸以及氨中的氮元素轉(zhuǎn)化為尿素，因而是生物體內(nèi)的 主要排氨方式。動物利用新陳代謝將體內(nèi)多余的氮元素轉(zhuǎn)化為尿素的主要器官是肝臟，體 內(nèi)的精氨酸在精氨酸酶的催化作用下水解，產(chǎn)生尿素和鳥氨酸。精氨酸水解后產(chǎn)生的鳥氨 酸，將會與氨甲酰磷酸反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生瓜氨酸，瓜氨酸會進(jìn)一步與天冬氨酸反應(yīng)而生成精氨 基琥珀酸，精氨基琥珀酸最終會在酶的催化作用下進(jìn)一步被分解為延胡索酸以及精氨酸等 產(chǎn)物。由于該反應(yīng)的第一步是將精氨酸轉(zhuǎn)化為尿素，反應(yīng)到最后又生成了精氨酸，周而復(fù) 始，所以該反應(yīng)稱為尿素循環(huán)。由于目前全世界氨基酸產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，各地的科學(xué)家逐漸 認(rèn)識到了 L-鳥氨酸的多種生物功能，其中日本最為突出，他們在20世紀(jì)40年代就開始對 L-鳥氨酸有所研究，在10-20年后就有許多文章發(fā)表，且多數(shù)是以專利的形式發(fā)表的。其 中包括鳥氨酸生產(chǎn)菌株、鳥氨酸高產(chǎn)菌株的選育、鳥氨酸的定量分析以及發(fā)酵法生產(chǎn)-鳥 氨酸的發(fā)酵條件優(yōu)化等，并且以專利文獻(xiàn)的形式發(fā)表。但是此期間在國內(nèi)卻很少聽到對 于-鳥氨酸的研究。直至1998年至2000年間，才報道有張克旭、潘韻和陳寧等人曾做過 關(guān)于L-鳥氨酸的菌種篩選和發(fā)酵方面的研究，有幾篇論文發(fā)表。與國外的研究相比，我國 L-鳥氨酸產(chǎn)業(yè)還處于起步階段，所研究的面很窄，而且研究進(jìn)展較慢，目前僅發(fā)展到搖瓶試 驗階段，要進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)還需要我們進(jìn)行大量的試驗和研究。和國外相比，我國對鳥氨酸 的研究有很大的差距，研究面窄，進(jìn)展不大，僅限于搖瓶試驗，離工業(yè)化生產(chǎn)還有很長的路 要走。
[0004] 鳥氨酸是精氨酸的衍生物，在醫(yī)藥、保健、食品和化工等領(lǐng)域具有廣泛用途，市場 需求逐年增長，國內(nèi)外尚無大規(guī)模生產(chǎn)的報道。鳥氨酸生產(chǎn)方法主要有化學(xué)法、微生物發(fā)酵 法和酶轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)法工藝繁雜，環(huán)境污染嚴(yán)重，副產(chǎn)物多且不易分離；微生物發(fā)酵法由于 缺乏性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌株和生產(chǎn)工藝的系統(tǒng)研究，限制了該方法的發(fā)展和應(yīng)用。酶轉(zhuǎn)化法 是精氨酸在精氨酸酶的專一作用下生成鳥氨酸，產(chǎn)品純度高，是最具開發(fā)潛力的鳥氨酸生 產(chǎn)方法，優(yōu)質(zhì)廉價的精氨酸原料和轉(zhuǎn)化酶的獲得是該方法的關(guān)鍵。
[0005] 鳥氨酸的生產(chǎn)方法有4種：發(fā)酵法：酶法；化學(xué)合成法和蛋白質(zhì)水解提取法。
[0006] (1)發(fā)酵法發(fā)酵法是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通過對菌株的 質(zhì)誘變等處理，選育出各種營養(yǎng)缺陷型及氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性變異株，以解除代謝調(diào)節(jié) 中的反饋抑制與阻遏，達(dá)到過量合成某種氨基酸的目的。發(fā)酵法包括直接發(fā)酵法和添加前 體發(fā)酵法。氨基酸產(chǎn)生菌是實現(xiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的前提，在氨基酸發(fā)酵的建立和改進(jìn)中 起著非常重要的作用。根據(jù)氨基酸產(chǎn)生菌的遺傳性狀，可將其分為四類：第一類為直接使 用野生型菌株由糖和銨鹽發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸，如谷氨酸；第二類為營養(yǎng)缺陷型變異株；第三 類為氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性變異株；第四類為營養(yǎng)缺陷型（或滲漏型）兼結(jié)構(gòu)類似物抗件 變異株。應(yīng)用發(fā)酵法生產(chǎn)鳥氨酸因產(chǎn)酸水平較低實用價值不大。發(fā)酵法主要是利用精氨酸 (Arg-)或瓜氨酸（Cit-)的營養(yǎng)缺陷型突變株來積累鳥氨酸。Takay asu等在營養(yǎng)缺陷型 菌株的基礎(chǔ)上篩選到具有霉酚酸抗性的突變株，最高產(chǎn)量可達(dá)50g/L ;李環(huán)等利用混合菌 種發(fā)酵生產(chǎn)鳥氨酸，產(chǎn)量達(dá)40g/L左右。發(fā)酵法原料成本低廉，但是發(fā)酵液中成分復(fù)雜，后 續(xù)分離困難。
[0007] (2)化學(xué)合成法化學(xué)法制備鳥氨酸根據(jù)化學(xué)反應(yīng)機(jī)理可分為有機(jī)合成法和精氨酸 水解法兩種。該法采用基礎(chǔ)化工原料合成鳥氨酸，原料來源廣泛且成本低。然而該法經(jīng)過 多步化學(xué)反應(yīng)合成，收率偏低；其原料中的氰化氫為劇毒致癌物，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)盡量避免 使用。化學(xué)法合成出的鳥氨酸為DL型混合物，產(chǎn)物的手性拆分亦給該工藝增加了難度和成 本，這些方面都成為該法的主要缺陷所在?；瘜W(xué)法是利用弱堿水解精氨酸得到鳥氨酸和少 量瓜氨酸?；瘜W(xué)法生產(chǎn)鳥氨酸產(chǎn)物為DL-型外消旋體，分離困難，生產(chǎn)過程不易控制，現(xiàn)已 被淘汰。
[0008] (3)蛋白質(zhì)水解提取法以毛發(fā)、血粉及廢蠶絲等蛋白質(zhì)為原料，通過酸、堿或酶水 解成多種氨基酸混合物，經(jīng)分離純化獲得各種氨基酸的方法稱為水解法。隨著氨基酸生產(chǎn) 技術(shù)的進(jìn)步。由蛋白質(zhì)水解法提取氨基酸這一古老的生產(chǎn)方法受到很大的沖擊，傳統(tǒng)的水 解法生產(chǎn)谷氨酸已失去其存在的價值。
[0009] (4)酶法酶法生產(chǎn)鳥氨酸就是利用動植物或微生物體內(nèi)的精氨酸酶作催化劑，水 解精氨酸，生成鳥氨酸和尿素；酶法生產(chǎn)氨基酸具有工藝簡單、周期短、耗能低、專一性強(qiáng)、 收率高等特點(diǎn)。L-精氨酸酶廣泛存在于動物的肝臟、植物、酵母和細(xì)菌中傳統(tǒng)的酶法制備鳥 氨酸方法，采用以牛肝為酶源，從牛肝中提取L-精氨酸酶，以成品精氨酸為合成底物轉(zhuǎn)化 鳥氨酸。酶法生產(chǎn)鳥氨酸專一性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，避免采用氰化氫等有毒化學(xué)品，同時底 物轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)品較純，有利于后續(xù)分離，但是精氨酸酶的來源不易，底物精氨酸的成本也 較高。如何獲得廉價的合成底物和酶源是這一方法能否成功應(yīng)用的關(guān)鍵。
[0010] 本技術(shù)采用發(fā)酵法生產(chǎn)的精氨酸純化液為原料，采用假單胞菌產(chǎn)生的精氨酸酶轉(zhuǎn) 化生產(chǎn)鳥氨酸，原料易得，酶成本低廉，結(jié)合固定化酶技術(shù)，可節(jié)約鳥氨酸生產(chǎn)成本，制造出 高質(zhì)量的產(chǎn)品。申請人多年來致力于發(fā)酵法生產(chǎn)精氨酸及其衍生物關(guān)鍵技術(shù)的研究，擁有 年產(chǎn)500噸的精氨酸生產(chǎn)線。鑒于國內(nèi)外市場需求強(qiáng)勁的現(xiàn)狀，申請人對鳥氨酸高效生物 制造技術(shù)及產(chǎn)業(yè)化進(jìn)行研究，創(chuàng)造性的提出了微生物酶法生產(chǎn)鳥氨。依托現(xiàn)有精氨酸技術(shù) 和原料優(yōu)勢，選育了生產(chǎn)鳥氨酸的精氨酸酶的高效菌株，以精氨酸為原料通過酶轉(zhuǎn)化獲得 鳥氨酸。本發(fā)明產(chǎn)品純度高易分離，同時克服了原料和酶昂貴不易獲取的劣勢，具有規(guī)模化 生產(chǎn)的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于提供一株產(chǎn)精氨酸酶的菌株MQ0-154,本發(fā)明經(jīng)過對假單胞菌 (假單胞菌購自北京微生物菌種保藏中心）進(jìn)行紫外誘變和化學(xué)誘變，篩選到一株酶活性 較高的菌株，經(jīng)分離純化后獲得菌株MQ0-154,其保藏編號為：CGMCC No. 10728 ;保藏單位 為：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏日期為：2015年4月21日；保藏 地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
[0012] 菌株MQ0-154的生物特性為：菌株MQ0-154接種到斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)24h，成 乳白色菌落，濕潤，表面無光澤，菌苔厚且不透明，菌落較大，邊緣不規(guī)則菌體呈桿狀，細(xì)胞 長約3-4 μ m，直徑1-2 μ m，具有內(nèi)生芽孢，不能運(yùn)動，好氧或兼性厭氧。菌株MQ0-154的分 類命名為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringensis)。
[0013] 利用菌株MQ0-154制備精氨酸酶的方法，步驟如下：
[0014] (1)斜面培養(yǎng)：將菌株MQ0-154在無菌條件下接種到斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng) 溫度為33°C，培養(yǎng)時間為24h ;
[0015] 斜面培養(yǎng)基：葡糖糖 25g，魚蛋白胨 15g，KH2PO4O. 6g，MgSO4 ·7Η200· 5g，K2HPO4L 5g， 瓊脂16g，加純凈水至1L，用NaOH調(diào)pH至為7. 0,滅菌溫度115°C，15分鐘。
[0016] (2)種子擴(kuò)大培養(yǎng)：從步驟（1)的斜面培養(yǎng)基上挑取菌落，加水稀釋獲得菌體溶 液，稀釋后的濃度為3 X 105-5 X IO5個/mL，將菌體溶液接種到種子培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)， 接種量為10% (v/v)，擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為30°C，培養(yǎng)時間