一種脂肪組織葉酸差異表達(dá)基因篩選的樣本制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子營養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及到一種脂肪組織葉酸差異表達(dá)基因篩選的 樣本制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 養(yǎng)雞產(chǎn)業(yè)以高效率、低成本的優(yōu)勢，迅速發(fā)展為我國畜牧業(yè)領(lǐng)域中產(chǎn)業(yè)化程度最 高的行業(yè)，雞肉已發(fā)展成為我國第二大肉類消費品。然而，雞肉質(zhì)粗糙松軟、寡淡無味，越 來越不為人們接受，尤其是雞體內(nèi)脂肪(尤其是腹脂）含量越來越高，這嚴(yán)重影響了雞肉質(zhì) 量，降低了飼料轉(zhuǎn)化率，同時提高了肉雞猝死癥等肉雞特有疾病的發(fā)生率高，增強(qiáng)了肉雞對 疾病的易感性，導(dǎo)致肉雞死亡率較高，經(jīng)濟(jì)效益下降。雞肉的風(fēng)味除了與品種有關(guān)外，其基 礎(chǔ)代謝中營養(yǎng)物質(zhì)的分配也是重要因素，營養(yǎng)調(diào)控是改善家禽肉品質(zhì)的主要途徑之一。因 此，降低肉雞體內(nèi)脂肪含量已成為國內(nèi)外養(yǎng)禽業(yè)關(guān)注的熱點和重點問題，有效控制肉雞腹 脂沉積也成為當(dāng)前優(yōu)質(zhì)肉雞選育的重要目標(biāo)。
[0003] 葉酸是指具有蝶酰谷氨酸這一共同結(jié)構(gòu)的一類B族維生素，當(dāng)葉酸在動物體內(nèi) 轉(zhuǎn)化成具有輔酶活性的四氫葉酸（Tra )時，它便作為一碳單位的供體和受體參與許多 關(guān)鍵反應(yīng)，包括氨基酸和核酸的代謝；另外，葉酸也具有一定的抗氧化功能。最近研究表 明雌性大鼠飼料中葉酸攝入受限能增加其子代大鼠內(nèi)臟脂肪含量和脂類代謝（Kumar等， 2013)。Lam等（2009)發(fā)現(xiàn)葉酸能顯著調(diào)控糖尿病小鼠 β-腎上腺素蛋白的表達(dá)和脂肪分 解，這表明葉酸營養(yǎng)與動物脂肪代謝具有相關(guān)性，但是葉酸對動物脂肪的調(diào)控途徑以及對 后代的生長調(diào)控的影響還有諸多問題不明朗。
[0004] 數(shù)字基因表達(dá)譜測序主要用于某物種的特定組織或細(xì)胞在特定生物過程中的基 因表達(dá)定量研究?；谛乱淮咄繙y序平臺和信息分析平臺，可進(jìn)行全基因組水平的基 因表達(dá)差異研究，實現(xiàn)了表達(dá)譜分析的數(shù)字化、高效性，具有定量更準(zhǔn)確、可重復(fù)性更高、檢 測范圍更廣、分析更可靠等特點。
[0005] 本發(fā)明特為這種對應(yīng)特定的差異表達(dá)基因的篩選分析，設(shè)計并通過實驗驗證，給 出了樣本的制備方法，為差異表達(dá)基因的數(shù)據(jù)化分析提供了有效的數(shù)據(jù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種脂肪組織葉酸差異表達(dá)基因篩選的樣本制備方法，目的是為這 種對應(yīng)特定的差異表達(dá)基因的篩選分析，設(shè)計并通過實驗驗證，給出樣本的制備方法，為差 異表達(dá)基因的數(shù)據(jù)化分析提供有效的數(shù)據(jù)支持。
[0007] 本發(fā)明方法可以針對所有特定雞種實施，只要能夠正常繁育的雞種，都可以應(yīng)用 本方法進(jìn)行取樣。
[0008] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是： 一種脂肪組織葉酸差異表達(dá)基因篩選分析的基因片段樣本制備方法，其特征在于，由 以下步驟組成： 1)葉酸缺乏雞只群對比設(shè)計： 選擇30周齡AA肉種母雞各50只，按遺傳背景相同、體重相近的原則，隨機(jī)等量分為葉 酸正常組和葉酸缺乏組，投喂同樣飼料，葉酸正常組飼料中添加2. 0 mg葉酸每kg飼料，每 組設(shè)5個重復(fù)，每個重復(fù)10只雞，種公雞飼喂正常葉酸飼料，人工授精，試驗期12周，最后 3天收集兩組的種蛋各90枚，共180枚； 分別選用上述2組的種蛋進(jìn)行孵化，按照每組80只挑選孵化后的肉仔雞，共160只，分 別飼養(yǎng)，分組同上，每組設(shè)5個重復(fù)，每個重復(fù)16只。按1-3周齡和4-6周齡兩個階段配置 肉仔雞日糧，飼喂相同含葉酸飼料；或?qū)⑸鲜鲎须u重復(fù)上述葉酸對照設(shè)計多次；具體次數(shù) 根據(jù)具體需求確定，舉例來說，在次數(shù)少時結(jié)果分析可信度低，以及次數(shù)過多統(tǒng)計學(xué)意義顯 著降低之間找到一個平衡點。
[0009] 2)脂肪組織樣品采集： 分別于42日齡時，每組仔雞禁食12 h且自由飲水，每組隨機(jī)選取3仔雞屠宰，立即用 滅菌手術(shù)刀片把腹脂切割成0. 5-1 g左右片狀，每仔雞切到的樣本放于I. 5 ml離心管中， 液氮保存； 3)總RNA提取及mRNA富集純化： 提取步驟2所得樣本的總RNA，按以下說明進(jìn)行mRNA富集純化：分別將兩臺PCR儀預(yù) 熱到65°C和80°C備用，取1重量份RNA樣品放入PCR管中，使得PCR管得空余體積在95% 以上，用RNase-free water稀釋約10倍，65°C溫育5min，取一定量磁珠，用適量binding buffer洗兩次，再加入少量binding buffer與溫育后的樣品，混勾，室溫下靜置10 min后， 棄掉上清液，用與PCR管同體積的washing buffer將結(jié)合有mRNA的磁珠洗兩次，之后加入 PCR管1/4體積的10 mM Tris ·Η(：1，-80°(：溫育2min，將mRNA從磁珠上洗脫下來，置于磁力 架上取上清液，將上清液與PCR管1/4體積的binding buffer混勾，置于65°C下5 min，同 時用PCR管同體積的washing buffer清洗磁珠兩次，將上步處理后的樣品與磁珠混合，吹 打后混勾，于室溫靜置lOmin，之后用PCR管1/4體積的washing buffer清洗雜質(zhì)兩次，用 足量10 mM Tris · HCl將mRNA從磁珠上洗脫下來，最終取清液；所述磁珠為富含ploy(T) 低吸附磁珠。
[0010]目前的純化方法中，對于mRNA富集純化的得到清液的質(zhì)量要求較高，但是往往在 提取率方面要求不高，本發(fā)明的富集純化步驟，在立足于采集的樣本量不大的情況下，通過 對磁珠的多次處理，使得mRNA的純化提取率有了比較有效的保證，避免了非要大量、巨量 取樣才能保證后續(xù)檢測，大手大腳的浪費現(xiàn)象。
[0011] 4)打斷 mRNA : 預(yù)熱PCR儀到70°C，IOX Fragmentation Buffer與mRNA的清液體積比為1 :9,混勾后， 70°C下4min，加入少量Fragmentation Stop Solution，迅速冷卻并轉(zhuǎn)移到無 RNase離心管 中，并加入沉淀反應(yīng)溶液，渦旋混勻，-80°C過夜，4°C離心機(jī)14000rpm，冷凍離心25min，用 移液槍移去無水乙醇，用70%乙醇溶液清洗，再次冷凍離心25min，小心吸出70%乙醇，室溫 下風(fēng)干10min，再用無 RNase水懸浮提取出溶液中的RNA ; 本發(fā)明經(jīng)過兩次，尤其是在小心吸出70%乙醇之前又進(jìn)行冷凍離心，是為了保證RNA的 溶解度，這是經(jīng)過多次實驗，在保障打斷mRNA片段的溶解度的簡便可靠的方法，在設(shè)計方 法中付出了創(chuàng)造性勞動，不是簡單就能夠想到的。
[0012] 5)cDNA 的合成： 利用反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物將提取溶液中的mRNA片段反轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一條鏈，然 后加入緩沖液、dNTPs，在RNase H和DNA polymerase I的作用下合成第二條cDNA鏈； 6) 片段選擇： 對反轉(zhuǎn)錄合成的雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、3'末端加 A、連接接頭，通過瓊脂糖凝膠 電泳，篩選一定范圍大小的片段，用QIAGEN試劑盒純化； 7) PCR擴(kuò)增： 利用到的試劑有 Water、PCR primer PE 2.0、PCR primer PE 1.0、Phusion DNA Polymerase、前步純化產(chǎn)物，體積比依次為18 :3 :3 :40: 16: 80,反應(yīng)程序：98°C 30 8〇。一981€40 86。，651€30 86。，721€30 86。\10至12循環(huán)一72。(：下5 11^11一4。(：保 持，反應(yīng)結(jié)束后用QIAGEN試劑盒純化，并回溶。
[0013] 8)基因測序： 將前步處理好的樣品進(jìn)行精確定量，然后在芯片（flow cell)表面進(jìn)行橋式PCRJi DNA片段擴(kuò)增為單分子DNA簇(此過程在Cluster Station中進(jìn)行)。單分子DNA簇長好 后將flow cell移入Hi-Seq中，進(jìn)行測序。并利用FASTX檢測過濾掉低質(zhì)量reads，這里 具體指過濾掉質(zhì)量小于20、堿基的總數(shù)目小于整個reads總數(shù)目的30-25%的reads。
[0014] 這里選擇過濾掉質(zhì)量小于20、堿基的總數(shù)目小于整個reads總數(shù)目的30-25%的 reads，也是根據(jù)選用的DNA片段測試用而考慮的，過濾過少不符合實際需求，過濾太多影 響測試結(jié)果。
[0015] 特異基因篩選：針對基因設(shè)計引物；在每個基因內(nèi)各設(shè)計兩對引物，每對引物分 布在相應(yīng)基因內(nèi)不同地方以確保其特異性；以保證PCR產(chǎn)物大小符合預(yù)期大小。
[0016] PCR擴(kuò)增的步驟也是申請人通過創(chuàng)造性勞動才得到的，一方面試劑配比不合適或 者循環(huán)數(shù)不夠，擴(kuò)增的效果不好，但是循環(huán)數(shù)太高，酶濃度太高，擴(kuò)增程度又是超出所需的， 浪費人力物力，對于需要很多個種類的雞種的樣品都要提取測試的場合，大大地提高了無 謂的工作量。
[0017] 前述步驟6和7中利用的該QIAGEN試劑盒是QIAquick PCR Purification Kit， 單位 50rxn 或 250rxn。
[0018] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)中僅有理論與提法，尚無具體的針對實際雞群分析的脂肪組織葉酸 差異表達(dá)基因篩選分析。本發(fā)明的有益效果在于，獨創(chuàng)性地提出了如何具體地為對應(yīng)葉酸 缺乏的雞在基因上可能的差異表達(dá)如何準(zhǔn)備樣本進(jìn)行檢測，對于后續(xù)基因差異檢測的有效 性，提供了切實的保證。
【附圖說明】
[0019] 圖1是本發(fā)明的一種脂肪組織葉酸差異表達(dá)基因篩選分析的樣本制備方法流程 圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合附圖和具體實例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0021] 以下實施例僅提供用于進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點，而不應(yīng)理解為對本發(fā)明 的限制。
[0022] 實施例1 : 一種脂肪組織葉酸差異表達(dá)基因篩選分析的基因片段樣本制備方法，其特征在于，由 以下步驟組成： 1)葉酸缺乏雞只群對比設(shè)計： 采用單因子試驗設(shè)計，選擇30周齡的AA肉種雞各50只，按遺傳背景相同、體重相近 的原則，隨機(jī)分為2個處理組，葉酸正常組（normal folate, NF;對照組）和葉酸缺乏組 (Folate deficiency, FD;試驗組)。配制玉米-大豆型基礎(chǔ)日糧，其中葉酸缺乏組飼喂基 礎(chǔ)日糧(預(yù)混料不加葉酸)，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧添加2.0 mg/kg葉酸的飼料。每組設(shè)5個 重復(fù)，每個重復(fù)10只雞，籠養(yǎng)，每籠1只，按照AA肉種雞產(chǎn)蛋期飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)，建立嚴(yán)格的 飼養(yǎng)管理制度，并做好詳細(xì)的日常管理記錄，包括飼料用量、雞康健狀況、產(chǎn)蛋情況等。種公 雞飼喂正常葉酸飼料，人工授精。試驗期12周，最后3天收集種蛋各90枚，共180枚。
[0023] 分別選用上述2組的種蛋進(jìn)行孵化，按照每組80只挑選孵化后的肉仔雞，共160 只，分別飼養(yǎng)，分組同上，每組設(shè)5個重復(fù)，每個重復(fù)16只。按1-3周齡和4-6周齡兩個階 段配置肉仔雞日糧，在相同環(huán)境條件下飼養(yǎng)?；?qū)⑸鲜鲎须u重復(fù)上述葉酸對照設(shè)計多次；具 體次數(shù)根據(jù)具體需求確定，舉例來說，在次數(shù)少時結(jié)果分析可信度低，以及次數(shù)過多統(tǒng)計學(xué) 意義顯著降低之間找到一個平衡點。
[0024] 2)脂肪組織樣品采集： 分別于42日齡時每組隨機(jī)選取3仔雞屠宰(禁食12 h，自由飲水)，立即用滅菌手術(shù)刀 片把腹脂切割成〇. 5-1 g左右大小，分裝3個I. 5 ml離心管中，液氮保存。
[0025] 3)總RNA提取及mRNA富集純化： 提取步驟2所得樣本的總RNA，按以下說明進(jìn)行mRNA富集純化：利用富含ploy(T)低 吸附磁珠對Total RNA中的mRNA進(jìn)行富集純化處理。具體如下：分別將兩臺PCR儀預(yù) 熱到65°C和80°C備用；取5 Pg RNA樣品放入200 μL PCR管中，用RNase-free water稀 釋至5〇KL，置于65°C溫育5min ;取15KL磁珠，用200KL binding buffer洗兩次，加入50 μL binding buffer與溫育后的樣品混勾，室溫下靜置10 min后，棄掉上清液；用20〇μL washing buffer將結(jié)合有mRNA的磁珠洗兩