368-P-SE 的結(jié)構(gòu)圖。 SS: α信號(hào)肽序列。BG、CBH、EG:分別為β-葡萄糖苷酶基因、纖維素外切葡聚糖酶基因、纖 維素內(nèi)切葡聚糖酶基因。pPGK:組成型啟動(dòng)子Pgkl。CYCl TT:來(lái)自于細(xì)胞色素 C的轉(zhuǎn)錄終 止子。rDNA:來(lái)自于釀酒酵母的同源rDNA基因。Ampf :氨節(jié)抗性基因 。ColE ori :大腸桿菌 復(fù)制起始位點(diǎn)。URA3:尿嘧啶合成基因。
【具體實(shí)施方式】 [0025] 實(shí)施例1
[0026] 重組菌INVSc-P-SC在同步糖化發(fā)酵中利用玉米芯纖維素為唯一碳源生產(chǎn)生物乙 醇。
[0027] 1、在YPD固體平板上挑取重組酵母INVSc-P-SC的單菌落接入50mL YH)液體培養(yǎng) 基，28°C，200rpm搖瓶培養(yǎng)。
[0028] 2、在搖瓶培養(yǎng)菌液濃度均達(dá)到0D6。。= 2. 0時(shí)，將INVSc-P-SC的培養(yǎng)液15ml作為 種子液接種至IL反應(yīng)器的YPC(1%酵母粉，2%蛋白胨，2%玉米芯）液體培養(yǎng)基中，在28°C 恒溫發(fā)酵。
[0029] 3、連續(xù)培養(yǎng)120個(gè)小時(shí)，YPC液體培養(yǎng)基的上清利用氣相色譜進(jìn)行乙醇含量測(cè)定。 測(cè)得乙醇含量為2. 35g/L。
[0030] 實(shí)施例2
[0031] 重組菌INVSc-P-SE在同步糖化發(fā)酵中利用玉米芯纖維素為唯一碳源生產(chǎn)生物乙 醇。
[0032] 1、在YPD固體平板上挑取重組酵母INVSc-P-SE的單菌落接入50mL YH)液體培養(yǎng) 基，28°C，200rpm搖瓶培養(yǎng)。
[0033] 2、在搖瓶培養(yǎng)菌液濃度均達(dá)到0D6。。= 2. 0 (誤差不超過(guò)5% )時(shí)，將INVSc-P-SE 的培養(yǎng)液15ml作為種子液接種至IL反應(yīng)器的YPC(1%酵母粉，2%蛋白胨，2%玉米芯）液 體培養(yǎng)基中，在28°C恒溫發(fā)酵。
[0034] 3、連續(xù)培養(yǎng)120個(gè)小時(shí)，取YPC液體培養(yǎng)基的上清利用氣相色譜進(jìn)行乙醇含量測(cè) 定。測(cè)得乙醇含量為3. 26g/L。
[0035] 實(shí)施例3
[0036] 重組菌INVSc-P-SB、INVSc-P-SC、INVSc-P-SE混合菌利用玉米芯纖維素為唯一碳 源進(jìn)行同步糖化發(fā)酵。
[0037] 1、在YPD固體平板上挑取重組酵母INVSc-P-SB、INVSc-P-SC、INVSc-P-SE的單菌 落接入50mL YH)液體培養(yǎng)基，28°C，200rpm搖瓶培養(yǎng)。
[0038] 2、在搖瓶培養(yǎng)菌液濃度均達(dá)到0D6。。= 2. 0 (誤差不超過(guò)5% )時(shí)，將INVSc-P-SB、 INVSc-P-SC、INVSc-P-SE的培養(yǎng)液各5ml混勻，接種至lL反應(yīng)器的YPC(l%酵母粉，2%蛋 白胨，2%玉米芯）液體培養(yǎng)基中，在28°C恒溫發(fā)酵。
[0039] 3、連續(xù)培養(yǎng)120個(gè)小時(shí)，取YPC液體培養(yǎng)基的上清利用氣相色譜進(jìn)行乙醇含量測(cè) 定。測(cè)得乙醇含量為6. 37g/L。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用玉米芯纖維素為唯一碳源進(jìn)行同步糖化發(fā)酵的方法，其特征在于構(gòu)建能利 用纖維素的釀酒酵母INVSc-P-SB、INVSc-P-SC、INVScP-SE重組菌株的具體步驟為： a) 載體pHBM368_pgk的構(gòu)建 以表達(dá)載體PHBM368為基礎(chǔ)，構(gòu)建帶有組成型強(qiáng)啟動(dòng)子pgkl的表達(dá)載體pHBM368-pgk ; 利用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增5' -端和3' -端引入Nde I酶切位點(diǎn)和Not I酶切位點(diǎn)的pgkl啟 動(dòng)子序列；通過(guò)T4DNA Ligase將pgkl啟動(dòng)子序列與經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde I和Not I消化 的 PHBM368 相連接得到 pHBM368-pgk ; b) 分泌型表達(dá)載體 pHBM368-P-SB、pHBM368-P-SC、pHBM368-P-SE 的構(gòu)建 按基因文庫(kù)號(hào)分別合成(6-葡萄糖苷酶基因bg (GeneBank:AF163097)、纖維素外 切葡聚糖酶基因cbh (GeneBank :AY861348)、纖維素內(nèi)切葡聚糖酶基因eg (GeneBank: EU169241)，在bg、cbh、eg的5'-端和3'-端分別引入SnaB I酶切位點(diǎn)和Xba I酶切位點(diǎn)。 將從PPIC9K載體中PCR擴(kuò)增出5' -端和3' -端分別帶有Not I和SnaB I的信號(hào)肽SS序 列，用 T4DNA Ligase 將 SS 分別與 bg、cbh、eg 相連得到 SS-bg、SS-cbh、SS_eg ;再通過(guò) T4DNA Ligas利用Not I及Xba I酶切位點(diǎn)將SS-bg、SS-cbh、SS-eg連接到經(jīng)Not I和Xba I酶 切的 pHBM368-pgk 載體上，得到重組載體 pHBM368-P-SB、pHBM368-P-SC、pHBM368-P-SE ; c) 釀酒酵母的轉(zhuǎn)化 用 Hpa I 將 pHBM368-P-SB、pHBM368-P-SC、pHBM368-P-SE 線性化，通過(guò)電轉(zhuǎn)化到釀酒 酵母INVScl中；以2%羧甲基纖維素為碳源代替YH)培養(yǎng)基中葡萄糖成分的固體培養(yǎng)基進(jìn) 行功能篩選，篩選出能利用纖維素的釀酒酵母INVSc-P-SB、INVSc-P-SC、INVScP-SE重組菌 株。2. -種利用玉米芯纖維素為唯一碳源進(jìn)行同步糖化發(fā)酵的方法，其特征在于發(fā)酵步驟 為： a) 在YPD固體培養(yǎng)基平板上挑取重組酵母INVSc-P-SB、INVSc-P-SC、INVScP-SE的單 菌落分別接入50mL YH)液體培養(yǎng)基，28°C，200rpm搖瓶培養(yǎng)； b) 在搖瓶培養(yǎng)菌液濃度達(dá)到0D6M=2. 0時(shí)，分別將INVSc-P-SC、INVSc-P-SE及 INVSc-P-SB、INVSc-P-SC、INVSc-P-SE三者的培養(yǎng)液各5ml混合的培養(yǎng)液15ml作為種子液 接種至IL反應(yīng)器的YPC液體培養(yǎng)基中，在28°C發(fā)酵。 c) 經(jīng)過(guò)110~120小時(shí)發(fā)酵后，氣相色譜檢測(cè)發(fā)酵液中乙醇濃度，乙醇濃度可達(dá)到 2. 35-6. 37g/L〇3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用玉米芯纖維素為唯一碳源進(jìn)行同步糖化發(fā)酵的方 法，其特征在于所述碳源可以為其他天然木質(zhì)纖維素，如玉米秸桿、水稻秸桿、小麥秸桿、高 粱秸桿，以此碳源進(jìn)行同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)纖維素乙醇。
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種利用玉米芯纖維素為唯一碳源進(jìn)行同步糖化發(fā)酵的方法。步驟為：構(gòu)建載體pHBM368-pgk；構(gòu)建分泌表達(dá)載體pHBM368-P-SB、pHBM368-P-SC、pHBM368-P-SE；將表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到能利用纖維素同步糖化發(fā)酵的重組釀酒酵母INVSc-P-SB、INVSc-P-SC、INVSc-P-SE。上述重組釀酒酵母可直接利用天然纖維素進(jìn)行同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。以玉米芯纖維素為唯一碳源，連續(xù)培養(yǎng)120個(gè)小時(shí)，乙醇含量達(dá)到2.35g/L～6.37g/L。上述重組釀酒酵母可單獨(dú)或混合進(jìn)行同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化效率高，廢物利用，節(jié)能環(huán)保，能方便地提供生物能源——乙醇。
【IPC分類】C12P7/10, C12P19/14, C12N15/81, C12N1/19, C12R1/865
【公開(kāi)號(hào)】CN105018517
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510418255
【發(fā)明人】江正兵, 宋慧婷, 李谞
【申請(qǐng)人】湖北大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年7月16日