一種zb轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)及其介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及建立一種基于斑馬魚ZB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，同時(shí)還公開 了該方法涉及的轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶真核表達(dá)及體外轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒的構(gòu)建方法，及其 在制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、研究基因功能和人類基因治療中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因轉(zhuǎn)移是當(dāng)前一項(xiàng)重要的生物技術(shù)手段，在研究基因功能、制備轉(zhuǎn)基因生物和 基因治療等領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 轉(zhuǎn)座子是一類在基因組上可以自由跳躍（復(fù)制或移位）的移動(dòng)DNA序列，首先由 Me. Clintock于20世紀(jì)40年代在玉米染色體中發(fā)現(xiàn)，以后又陸續(xù)在細(xì)菌、真菌及昆蟲等各 種生物中發(fā)現(xiàn)?？茖W(xué)家們利用轉(zhuǎn)座子能夠介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)發(fā)展完善了轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)細(xì)胞 質(zhì)顯微注射方法，DNA轉(zhuǎn)座系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)座酶含有核定位信號(hào)序列，可以介導(dǎo)目標(biāo)基因順利進(jìn) 入細(xì)胞核，注射可以不入核，直接進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)注射。轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)顯微注射技術(shù)正受到 重視，并取得了一些令人鼓舞的進(jìn)展，這可能是突破大型哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)瓶頸的新方 法。
[0004] 轉(zhuǎn)座子除了可以有效提尚以顯微注射技術(shù)為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備效率外，還 可以用于人類基因治療?；蛑委煹闹饕襟E包括目的基因的克隆、基因轉(zhuǎn)移、靶細(xì)胞的選 擇和臨床試驗(yàn)觀察等，其中基因轉(zhuǎn)移是基因治療的關(guān)鍵步驟。在基因治療中轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)基 因轉(zhuǎn)移的優(yōu)點(diǎn)是高效、安全。在過去十年中，轉(zhuǎn)座子已發(fā)展為基因治療中最常用的非病毒載 體。除此之外，轉(zhuǎn)座子還可以制備突變體，開展基因捕獲，應(yīng)用于功能基因組學(xué)研究。該技 術(shù)近年來在人類基因治療、鼠和斑馬魚等模式動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因制備和功能基因組學(xué)研究上的 已經(jīng)取得重要進(jìn)展。
[0005] DNA轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)是新一代轉(zhuǎn)基因技術(shù)，但具有自主轉(zhuǎn)座活性的 DNA轉(zhuǎn)座子在脊椎動(dòng)物中很少見。1996年，首次在白化青鏘（Oryziaslatipes)中發(fā)現(xiàn)具有 天然活性的脊椎動(dòng)物轉(zhuǎn)座子，即T 〇12轉(zhuǎn)座子，該轉(zhuǎn)座子已在模式生物斑馬魚轉(zhuǎn)基因、基因 和啟動(dòng)子捕獲方面進(jìn)行了較為廣泛的應(yīng)用。2008年，在金魚中發(fā)現(xiàn)了第二例具有自主轉(zhuǎn)座 活性的Tgf2轉(zhuǎn)座子，并且該轉(zhuǎn)座子與青鏘Τ 〇12轉(zhuǎn)座子元件十分相似。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種斑馬魚ZB轉(zhuǎn)座子以及基于該轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)介導(dǎo)的高效 基因轉(zhuǎn)移方法，提高鼠、斑馬魚等動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因制備效率，并可以有效應(yīng)用于細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染 整合、人類基因治療和基因捕獲等研究領(lǐng)域。
[0007] 本發(fā)明的ZB轉(zhuǎn)座子，源自于斑馬魚（zebrafish)基因組，因此命名為"ΖΒ"轉(zhuǎn)座子。 是一個(gè)具有轉(zhuǎn)座活性的DNA轉(zhuǎn)座子，隸屬于Tcl/mariner家族。原始的ZB元件約I. 4kb， 兩端各有一個(gè)對(duì)稱的203bp的末端反向重復(fù)序列，中間為啟動(dòng)子和1026bp的編碼轉(zhuǎn)座酶序 列。這種排列方式允許在TTAA核苷酸序列處以"剪切粘貼"機(jī)制介導(dǎo)轉(zhuǎn)座進(jìn)基因組。本發(fā) 明所涉及的高效轉(zhuǎn)基因方法就是建立在斑馬魚ZB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)基礎(chǔ)上。
[0008] 本發(fā)明所述的ZB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)來源于斑馬魚，主要由ZB轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒和ZB轉(zhuǎn)座 酶輔助質(zhì)粒構(gòu)成。
[0009] 本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒（pZB-Msc)包括斑馬魚ZB轉(zhuǎn)座子兩側(cè)末端重復(fù) 序列和Mscl插入克隆位點(diǎn)，插入克隆位點(diǎn)可以插入需要轉(zhuǎn)移的目的基因盒，該供體質(zhì)粒 的序列如 SEQ ID No. 1 所示。序列中 IR/DR(L) 133-350, IR/DR(R)363-572, ColE Origin 912-1792,Amp CDS 1856-2513,FlOrigin 2844-3300。
[0010] 本發(fā)明所述的斑馬魚ZB轉(zhuǎn)座子兩側(cè)末端重復(fù)序列來源于斑馬魚基因組活性轉(zhuǎn)座 子TCl/Mariner家族，側(cè)冀末端重復(fù)序列長為203個(gè)核苷酸序列，序列如SEQ ID No. 2所示。
[0011] 本發(fā)明所述的目的基因盒可以是報(bào)告基因表達(dá)盒，或者其它外源基因表達(dá)盒，或 者基因捕獲元件。
[0012] 本發(fā)明所述的ZB轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒包括兩種形式，一種是可以在細(xì)胞和體內(nèi)直接 表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的PCMV-ZB真核表達(dá)質(zhì)粒，另一種是pTNT-ZB體外轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，可以進(jìn)行體外 轉(zhuǎn)錄形成5'加帽ZB轉(zhuǎn)座酶的mRNA。
[0013] 本發(fā)明所述的pCMV-ZB真核表達(dá)質(zhì)粒包括病毒啟動(dòng)子序列（CMV)和ZB轉(zhuǎn)座酶 cDNA序列和SV40多聚腺苷酸（PolyA)組成；載體構(gòu)架來自pCMV-SB100X載體，所述病毒啟 動(dòng)子序列（CMV)長度為523個(gè)核苷酸序列，能夠指導(dǎo)下游基因的表達(dá)；所述ZB轉(zhuǎn)座酶cDNA 序列克隆自斑馬魚，長度為1026個(gè)核苷酸序列；所述SV40多聚腺苷酸（PolyA)長度為120 個(gè)核苷酸序列，該載體能夠自主表達(dá)轉(zhuǎn)座酶，該載體的序列如SEQ ID No. 3所示。
[0014] 本發(fā)明所述的pTNT-ZB體外轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒包括Sp6、T7啟動(dòng)子、ZB轉(zhuǎn)座酶cDNA序 列和T7轉(zhuǎn)錄終止序列（terminator)組成；載體構(gòu)架來自pTNT載體，所述Sp6啟動(dòng)子長度 為18個(gè)核苷酸序列，T7啟動(dòng)子長度為19個(gè)核苷酸序列；所述ZB轉(zhuǎn)座酶cDNA序列克隆自 斑馬魚，長度為1026個(gè)核苷酸序列；所述T7轉(zhuǎn)錄終止序列長度為36個(gè)核苷酸序列，載體能 夠利用mMessagemMachine kit (購自Ambion公司）試劑盒進(jìn)行ZB轉(zhuǎn)座酶5'加帽mRNA的 體外轉(zhuǎn)錄，該載體的序列如SEQ ID No. 4所示。
[0015] 本發(fā)明提供的基于斑馬魚ZB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移方法，經(jīng)過細(xì)胞和胚胎水平 驗(yàn)證能夠高效介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移，可應(yīng)用于多個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域：1)使用本發(fā)明中給出的方法可 有效地將目的基因盒插入到宿主基因組中，提尚基因轉(zhuǎn)移效率；2)與基因捕獲技術(shù)結(jié)合可 以有效開展動(dòng)物基因功能研究；3)可以介導(dǎo)進(jìn)行人類基因治療等。
【附圖說明】
[0016] 圖 I :pCMV_ZB 質(zhì)粒圖譜；
[0017] 圖2 :PCR擴(kuò)增ZB-ORF產(chǎn)物電泳圖；
[0018] 圖3 :pCMV-ZB質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳圖；
[0019] 圖4 φΤΝΤ-ΖΒ質(zhì)粒圖譜；
[0020] 圖5 φΤΝΤ-ΖΒ質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳圖；
[0021] 圖 6 :pZB-Msc 質(zhì)粒圖譜；
[0022] 圖7 :PCR擴(kuò)增ZB 3'產(chǎn)物電泳圖；
[0023] 圖8 :PCR擴(kuò)增ZB 5'產(chǎn)物電泳圖；
[0024] 圖9 :pT3-ZB-5質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳圖；
[0025] 圖10 :pZB-Msc質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳圖；
[0026] 圖11 :pZB-CAG-GFP質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳圖；
[0027] 圖 12 :PCR 擴(kuò)增 PGK-NEO-bGHpA 產(chǎn)物電泳圖；
[0028] 圖13 :pZB-PGK-NE0質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳圖；
[0029] 圖14 :MEF細(xì)胞G418抗性篩選陽性克隆圖；
[0030] 圖15 :ZB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎熒光圖；
[0031] 圖16 :不同轉(zhuǎn)座酶濃度顯微注射斑馬魚胚胎24h后熒光圖；
[0032] 圖17 :不同轉(zhuǎn)座酶濃度顯微注射斑馬魚胚胎5d后熒光圖；
[0033] 圖18 :不同轉(zhuǎn)座酶濃度斑馬魚陽性率結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下述實(shí)施例中提到的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0035] 實(shí)施例1、轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體pCMV-ZB和轉(zhuǎn)座酶體外轉(zhuǎn)錄載體pTNT-ZB的構(gòu)建
[0036] UZB轉(zhuǎn)座酶編碼區(qū)（ORF)的克隆
[0037] 以斑馬魚基因組DNA為模板，按表1中列舉的擴(kuò)增ZB-ORF的引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)座酶基 因片段。反應(yīng)體系為 50 μ 1，IOyL 5XSF BufferUyl dNTP、2yL 10 μΜ 引物 ZB-ORF F、2 μ I 10 μΜ 引物 ZB-ORF R(引物序列：ZB-ORF-F :ttCTCGAGACTAGTgccaccatgatgggtaa aaacaaagaactc(SEQ ID NO. 5) ；ZB-〇RF-R ：atGGTACCGGGCCCttaatactttgtagaaaagcctt(S EQ ID Ν0·6))、1μ1 Phanta? Super-Fidelity，lyl 斑馬魚基因組 DNA 模板，加超純水至 50 μ 1 (高保真酶購自諾唯贊公司）。PCR擴(kuò)增程序：94°C 40s，55°C 40s，72°C lm30s，循環(huán)30 次。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（如圖2)。將PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收，與T 載體連接，進(jìn)行TA克隆，篩選出陽性克隆測序，測序比對(duì)正確后保存供下一步連接用。
[0038] 2、轉(zhuǎn)座酶真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-ZB的構(gòu)建
[0039] 用限制性內(nèi)切酶Spel和Apal將ORF從T載體中切出，瓊脂糖凝膠回收。同時(shí)用 Spel 和 Apal 雙酶切 pCMV-SB100X(pCMV_SB100X[1]由 Max Delbrilck Center for Molecular Medicine, Berlin, Germany. Zsuzsanna Izsva^ k教授贈(zèng)送），切膠回收 3700bp 片段作為載 體框架。將ORF和載體框架連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Top 10，挑單菌落至液體培養(yǎng)基LB培 養(yǎng)，提質(zhì)粒進(jìn)行電泳及酶切鑒定（如圖3)，陽性克隆者命名為pCMV-ZB，pCMV-ZB質(zhì)粒圖譜 如圖1所示。
[0040] 3、轉(zhuǎn)座酶體外轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒pTNT-ZB的構(gòu)建
[0041] 用限制性內(nèi)切酶Xhol和Kpnl將ORF從T載體上切出，瓊脂糖凝膠回收。同時(shí)用 Xhol和Kpnl雙酶切pTNT載體（pTNT載體為商品化質(zhì)粒，購自Promega公司），切膠回收 2850bp片段。將上述1026bp和2850bp片段連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞ToplO，挑單菌落至 液體培養(yǎng)基LB培養(yǎng)，提質(zhì)粒進(jìn)行電泳及酶切鑒定（如圖5)，陽性克隆者命名為pTNT-ZB， pTNT-ZB質(zhì)粒圖譜如4所示。
[0042] 實(shí)施例1I、轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體的構(gòu)建
[0043] 1、轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒pZB-Msc載體構(gòu)建
[0044] I. lpT3-PST 載體的構(gòu)建
[0045] 首先采用高保真PCR法以PB[2]、SB[1]及T 〇12