一種g蛋白-偶聯(lián)受體活體示蹤方法及應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子影像學領(lǐng)域，具體地說新型G蛋白-偶聯(lián)受體（G Protein-Coupled Receptor，GPCR)活體示蹤方法，以人視紫紅質(zhì)為例，具體說明在其非功 能區(qū)即第一個胞內(nèi)環(huán)（Cytoplasmic Loop 1，CL1)中插入一分子eGFP，成功構(gòu)建一種新型 rhodopsinai-eGFP融合蛋白，通過焚光檢測rhodopsin在細胞內(nèi)分布。
【背景技術(shù)】
[0002] G蛋白-偶聯(lián)受體（G Protein-Coupled Receptor，GPCR)是存在于細胞膜上的參 與細胞信號轉(zhuǎn)導的重要蛋白，參與多種重要的生理過程，如突觸傳遞、細胞的增殖和分化以 及味覺和觸覺的感知等。GPCR均由七個跨膜螺旋構(gòu)成，螺旋之間由三個胞內(nèi)環(huán)和三個胞外 環(huán)連接，其N端一般與蛋白的插膜密切相關(guān)，而其C端一般是磷酸化位點并參與下游G蛋白 的激活，因此具有重要的作用。由于GPCR的重要作用，GPCR突變能導致多種疾病的發(fā)生。 由于GPCR為真核蛋白，它一般會經(jīng)歷復雜的糖基化加工和折疊過程，只有最終折疊正確的 蛋白才能經(jīng)歷從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體，最后成功插入細胞膜的完整過程。當GPCR突變后，輕 者蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，重者能引發(fā)蛋白的錯誤折疊，導致蛋白不能正確的插膜，甚至在細胞 內(nèi)發(fā)生聚集，并造成細胞死亡等嚴重后果。因此，GPCR的分子成像具有重要的價值，它能反 應GPCR是否正確插膜、表達水平高低以及是否聚集等豐富的信息，這對于研究GPCR相關(guān)的 疾病具有重要的意義。
[0003] 傳統(tǒng)的分子成像方法有組織染色或免疫染色、免疫熒光等方法。即通過特異性的 染料或熒光標記特異性抗體結(jié)合目標分子，最后借助顯色反應或熒光檢測來觀察目標分子 的分布。但上述方法僅適用于固定之后的組織和細胞，無法應用于活體細胞或組織。熒光 蛋白的出現(xiàn)極大地帶動了分子活體示蹤的發(fā)展，人們把熒光蛋白和目標蛋白進行融合表 達，最后通過熒光在活體細胞或組織中直接觀察目標蛋白的分布。綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP)具有熒光強度大，干擾因素少，發(fā)光穩(wěn)定等優(yōu)點，是目前廣泛應 用的一種熒光蛋白。因此，GPCR-GFP融合蛋白是GPCR分子活體示蹤的首選策略。
[0004] 視紫紅質(zhì)（rhodopsin)是廣泛存在于脊椎動物視網(wǎng)膜視桿細胞細胞膜上的光受 體蛋白，它由一分子配體視黃醛（retinal)和一分子視蛋白（opsin)構(gòu)成，屬于GPCR Class A家族。受到光照刺激后，視黃醛發(fā)生異構(gòu)，促使視紫紅質(zhì)蛋白發(fā)生一系列的構(gòu)象變化，并激 活下游的信號傳導，繼而產(chǎn)生一個傳向視神經(jīng)的信號，最終導致視覺的發(fā)生。視紫紅質(zhì)一共 有348個殘基，但其中有100多個位點的突變與先天性眼病的發(fā)生密切相關(guān)，如視網(wǎng)膜色素 變性和夜盲癥等，除少數(shù)突變體視紫紅質(zhì)已經(jīng)得到深入研究外，大部分的視紫紅質(zhì)突變體 的研究還處于一片空白。因此探索視紫紅質(zhì)突變與眼病的發(fā)生仍具有巨大的發(fā)展空間。
[0005] 研究視紫紅質(zhì)在細胞內(nèi)的分布、轉(zhuǎn)運和表達水平等對于探索視紫紅質(zhì)突變與眼病 的發(fā)生具有重要的價值。如導致北美人視網(wǎng)膜色素變性最常見的視紫紅質(zhì)P23H，由于突變 后的蛋白發(fā)生了嚴重的錯誤折疊，因此被滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，無法被正常轉(zhuǎn)運到細胞膜上，所 以無法執(zhí)行正常的光受體蛋白功能。P23H的致病原理在細胞水平和動物水平都得到了廣 泛的驗證，這主要得益于rhodopsin-GFP融合蛋白的建立，人們可通過GFP在細胞或視網(wǎng) 膜中直接觀測rhodopsin的分布。現(xiàn)有技術(shù)一般把GFP連接在rhodopsin的C端（CT)，其 目的是避免對其N端的干擾，從而達到不影響rh 〇d〇psinCT-GFP的插膜的目的。但是由于 rhodopsin的C端受到干擾，與野生型rhodopsin相比，rhodopsinCT_GFP的G蛋白轉(zhuǎn)導功能 和磷酸化效率大大降低，與野生型rhodopsin有著巨大的差距。顯然，rhodopsin CT-GFP不 是一個理想的融合表達策略。
[0006] 本發(fā)明提供了一種改進的rhodopsin-eGFP融合表達策略，即首次在rhodopsin 的非功能區(qū)-第一個胞內(nèi)環(huán)（Cytoplasmic Loop 1，CL1)處插入一分子增強型綠色 焚光蛋白（enhanced Green Fluorescent Protein，eGFP)，構(gòu)建出一種新型的融合蛋 白rhodopsinai-eGFP，從而有效避免對rhodopsin的N端和C端的干擾。經(jīng)實驗證明， rhodopsinai-eGFP與野生型rhodopsin呈現(xiàn)相似的糖基化加工和表達水平，并能正確轉(zhuǎn)運 到細胞膜上，因此是一種理想的rhodopsin活體示蹤指示探針。此外，由于eGFP的熒光強 度為GFP的6倍以上，因此rh 〇d〇pSinai-eGFP的熒光強度得到大大增強，從而更加利于熒 光檢測組織深度的增加?？傊?，本發(fā)明為研究rhodopsin相關(guān)眼病提供了有力的工具，并為 其他GPCR的研究提供有益的參考和新的啟發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了提供一種新型GPCR活體示蹤方法，具體來說就是通過構(gòu)建 一種新型GPCR-eGFP融合蛋白來直接觀測GPCR在活體細胞或組織中的分布位置、表達水平 以及狀態(tài)等，從而為GPCR相關(guān)疾病的發(fā)病機制的研究提供有價值的參考，并為融合蛋白的 構(gòu)建提供新的思路。本發(fā)明的特點是eGFP插入在GPCR的非功能區(qū)，從而避免對GPCR的功 能產(chǎn)生干擾。
[0008] 實現(xiàn)本發(fā)明目的的具體技術(shù)方案是：
[0009] 一種新型G蛋白-偶聯(lián)受體（G Protein-Coupled Receptor，GPCR)活體示蹤方 法，特點在于該方法是：在G蛋白-偶聯(lián)受體的非功能區(qū)插入一分子增強型綠色熒光蛋白 (enhanced Green Fluorescent Protein，eGFP)，實現(xiàn) GPCR-eGFP 融合表達，通過焚光檢測 GPCR在活體細胞中的分布。
[0010] 所述在G蛋白-偶聯(lián)受體的非功能區(qū)插入一分子增強型綠色熒光蛋白（eGFP)，是 在不干擾GPCR功能的前提下，對GPCR分子實現(xiàn)熒光標記，實現(xiàn)GPCR分子的活體實時觀測。
[0011] 一種新型人視紫紅質(zhì)（rhodopsin)和增強型綠色熒光蛋白（eGFP)融合表達方法， 其特征在于該方法是：在:rhodopsin的第一個胞內(nèi)環(huán)區(qū)（Cytoplasmic Loop 1，CL1)插入一 分子 eGFP，構(gòu)建 rhodopsinai_eGFP ;
[0012] 具體包括以下步驟：
[0013] 1)利用分段PCR法在rhodopsin的第一個胞內(nèi)環(huán)區(qū)引入一個單點突變K66M，即把 第66位的殘基賴氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?，在rhodopsin中引入一個獨特的Nde I酶切位點 (CATATG)；
[0014] 2)pCEP4_rhodopsinK66M 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HEK293S 細胞，通過 Western Blot 條帶確定 rhodopsinK66M與野生型rhodopsin在表達量和糖基化加工方面相似，從而確定K66是非關(guān) 鍵殘基，該位置適合eGFP的插入；
[0015] 3)通過PCR法從pcDNA3. 1-3' -eGFP上擴增出兩端帶有Nde I酶切位點的eGFP 基因，然后經(jīng)Nde I單酶切后，膠回收Nde I酶切后的eGFP基因；
[0016] 4)由于pCEP4質(zhì)粒上含有多個Nde I酶切位點，不適合進行單酶切實驗，用BamH I和Hind III雙酶切實驗和T4連接酶連接實驗把rhodopsinK66M從pCEP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)接到 pBAD24 質(zhì)粒上得到 pBAD24_rhodopsinK66M 質(zhì)粒；
[0017] 5)對pBAD24_rhodopsinK66M質(zhì)粒進行Nde I單酶切后，再用牛小腸堿性磷酸酶 (Calf Intestine Alkaline Phosphatase，CIAP)處理，防止 pBAD24_rhodopsinK66M 質(zhì)粒 在連接實驗中的自連；
[0018] 6) T4連接酶連接步驟3)中的Nde I酶切后的eGFP基因和步驟5)中的經(jīng)Nde I 酶切和牛小腸堿性磷酸酶處理后的pBAD24_rhodopsinK66M質(zhì)粒，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿 菌ToplO菌株，然后通過菌落PCR法篩選出eGFP正向插入的克隆，最后通過測序進一鑒定 構(gòu)建的 pBAD24-rhodopsinK66M_eGFP 質(zhì)粒即 pBAD24_rhodopsinai-eGFP 質(zhì)粒；
[0019] 7)測序正確后，再次通過BamH I和Hind III雙酶切實驗和T4連接酶連接實驗把 rhodopsinai_eGFP 從 pBAD24 質(zhì)粒轉(zhuǎn)接到 pCEP4 質(zhì)粒上，得到 pCEP4_rhodopsinai-eGFP 質(zhì) 粒；
[0020] 8)將 pCEP4_rhodopsinai-eGFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 HEK293S 細胞中，通過 Western Blot 和熒光實驗鑒定rhodopsinai-eGFP的表達。
[0021] 所述rhodopsinai_eGFP，避免了 eGFP對rhodopsin的重要功能區(qū)C端的干擾，是 一種改進后的rhodopsin焚光報告蛋白，更適合rhodopsin相關(guān)眼病的活體研究。
[0022] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果：
[0023] 熒光蛋白作為常見的標簽蛋白，可與目的蛋白進行融合表達，從而通過熒光對 目的蛋白進行觀測。一般的融合策略是把熒光蛋白插在目的蛋白的N端或者是C段，例 如人們構(gòu)建了多種rhodopsin和焚光蛋白的融合蛋白，如rhodopsin-GFP蛋白（Invest Ophthalmol Vis Sci 52(13) :9728-9736. )，r