一種神經(jīng)外科手術(shù)后顱內(nèi)細(xì)菌性感染常見致病細(xì)菌mlpa檢測探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病原微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種神經(jīng)外科手術(shù)后顱內(nèi)細(xì)菌性 感染常見致病細(xì)菌MLPA檢測探針及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)外科手術(shù)后顱內(nèi)細(xì)菌性感染最常表現(xiàn)為腦膜炎、硬膜下積膿癥或腦膿腫。國 外報(bào)道顏內(nèi)感染死亡率為27. 4%~35% [42,43]。國內(nèi)學(xué)者報(bào)道，重癥神經(jīng)外科手術(shù)后盧頁 內(nèi)細(xì)菌性感染死亡率可高達(dá)57% [44]。
[0003] 神經(jīng)外科手術(shù)后顱內(nèi)細(xì)菌性感染有幾十種致病細(xì)菌，常見的有近20種，來自近10 個(gè)不同細(xì)菌屬。大多數(shù)為革蘭氏陽性菌，其中最常見的病菌是金黃色葡萄球菌和表皮葡萄 球菌（分別可占31%和37% )，其次為鏈球菌屬和瘡皰丙酸桿菌（各占近10% )，多為皮 膚性菌群；而革蘭氏陰性菌中，腸桿菌屬和不動桿菌屬為主要病原菌（分別可占近10% )。 此外，綠膿假單胞菌和克雷伯氏肺炎菌是較常見的革蘭氏陰性致病菌，該類病菌主要來自 呼吸道和腸道[45]。而國內(nèi)外有關(guān)神經(jīng)外科手術(shù)后顱內(nèi)細(xì)菌性感染的流行病學(xué)和微生物學(xué) 特征研究結(jié)果大致與之類[46]，見表1。
[0004] 以PCR技術(shù)為代表的核酸檢測技術(shù)多年來已經(jīng)應(yīng)用到感染的致病微生物診斷。與 傳統(tǒng)檢測方法相比，核酸檢測技術(shù)應(yīng)用診斷神經(jīng)外科手術(shù)后細(xì)菌性感染具有很多優(yōu)勢。首 先，核酸檢測技術(shù)無需細(xì)菌的培養(yǎng)分離，只需提取DNA，甚至可直接進(jìn)行檢測，可大大提高 檢測速度；其次，核酸檢測技術(shù)具有非常高的特異性和靈敏度（理論上可檢測一個(gè)細(xì)胞）， 在保證檢測準(zhǔn)確性的前提下，大大提高了顱內(nèi)細(xì)菌性感染的陽性檢出率；再者，核酸檢測 技術(shù)不僅不受抗生素使用的影響，還可檢測致病菌抗生素耐藥基因，指導(dǎo)醫(yī)生用藥。常用 的核酸檢測技術(shù)主要包括焚光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization， FISH)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction, PCR)、實(shí)時(shí)定量 PCR(Real_time PCR)、廣譜 PCR(Broad range PCR)、多重 Real time PCR、微陣列芯片（Microarray)和測 序（Sequencing)。其中，從檢測特異性、敏感性和檢測速度等幾個(gè)方面講，實(shí)時(shí)定量PCR仍 然目前是用于腦脊液樣本中致病菌檢測最為理想的技術(shù)。然而，此技術(shù)檢測通量較低，最多 只能同時(shí)檢測8種致病菌，漏診率高。理論上講，盡管微陣列芯片和測序技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)大多 數(shù)致病菌的同時(shí)檢測，但是這些技術(shù)都涉及大量數(shù)據(jù)的復(fù)雜分析，需要具有專業(yè)技能的人 員?？傊?，目前，臨床上還沒有一次性診斷的神經(jīng)外科開顱手術(shù)后顱內(nèi)細(xì)菌性感染8以上種 致病菌的試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種神經(jīng)外科手術(shù)后顱內(nèi)細(xì)菌性感染 常見致病細(xì)菌MLPA檢測探針及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：
[0007] -種神經(jīng)外科手術(shù)后顱內(nèi)細(xì)菌性感染常見致病細(xì)菌MLPA檢測探針，包括第一組 探針至第十七組探針，依序?yàn)闄z測腦膜炎奈瑟氏菌、綠膿假單胞菌、沙門氏菌屬、嗜麥芽寡 養(yǎng)單胞菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、克雷伯氏肺炎菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、魯氏不動桿 菌、白喉?xiàng)U菌、緩癥鏈球菌、鮑氏不動桿菌、肺炎鏈球菌、痤瘡丙酸桿菌、李斯特氏菌、陰溝腸 桿菌和流感嗜血桿菌的探針，每組探針中分別含有左側(cè)探針LPO和右側(cè)探針RPO :
[0008] 第一組探針的左側(cè)探針LPO含有SEQ ID NO 1所示序列，右側(cè)探針RPO含有SEQ ID NO 2所不序列；
[0009] 第二組探針的左側(cè)探針LPO含有SEQ ID NO 3所示序列，右側(cè)探針RPO含有SEQ ID NO 4所不序列；
[0010] 第三組探針的左側(cè)探針LPO含有SEQ ID NO 5所示序列，右側(cè)探針RPO含有SEQ ID NO 6所示序列；
[0011] 第四組探針的左側(cè)探針LPO含有SEQ ID NO 7所示序列，右側(cè)探針RPO含有SEQ ID NO 8所不序列；
[0012] 第五組探針的左側(cè)探針LPO含有SEQ ID NO 9所示序列，右側(cè)探針RPO含有SEQ ID NO 10所不序列；
[0013] 第六組探針的左側(cè)探針LPO含有SEQ ID NO 11所示序列，右側(cè)探針RPO含有SEQ ID NO 12所不序列；
[0014] 第七組探針的左側(cè)探針LPO含有SEQ ID NO 13所示序列，右側(cè)探針RPO含有SEQ ID NO 14所不序列；
[0015] 第八組探針的左側(cè)探針LPO含有SEQ ID NO 15所示序列，右側(cè)探針RPO含有SEQ ID NO 16所示序列；
[0016] 第九組探針的左側(cè)探針LPO含有SEQ ID NO 17所示序列，右側(cè)探針RPO含有SEQ ID NO 18所不序列；
[0017] 第十組探針的左側(cè)探針LPO含有SEQ ID NO 19所示序列，右側(cè)探針RPO含有SEQ ID NO 20所不序列；
[0018] 第^^一組探針的左側(cè)探針LPO含有SEQ ID NO 21所示序列，右側(cè)探針RPO含有 SEQ ID NO 22所示序列；
[0019] 第十二組探針的左側(cè)探針LPO含有SEQ ID NO 23所示序列，右側(cè)探針RPO含有 SEQ ID NO 24所示序列；
[0020] 第十三組探針的左側(cè)探針LPO含有SEQ ID NO 25所示序列，右側(cè)探針RPO含有 SEQ ID NO 26所示序列；
[0021] 第十四組探針的左側(cè)探針LPO含有SEQ ID NO 27所示序列，右側(cè)探針RPO含有 SEQ ID NO 28所示序列；
[0022] 第十五組探針的左側(cè)探針LPO含有SEQ ID NO 29所示序列，右側(cè)探針RPO含有 SEQ ID NO 30所示序列；
[0023] 第十六組探針的左側(cè)探針LPO含有SEQ ID NO 31所示序列，右側(cè)探針RPO含有 SEQ ID NO 32所示序列；
[0024] 第十七組探針的左側(cè)探針LPO含有SEQ ID NO 33所示序列，右側(cè)探針RPO含有 SEQ ID NO 34所示序列。
[0025] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一組探針至第十七組探針的每一右側(cè)探 針的5'端連接有如SEQ ID NO 35所示的BsmI酶切位點(diǎn)序列，3'端連接有如SEQ ID NO 36 所示的Ecor V酶切位點(diǎn)序列。
[0026] 一種神經(jīng)外科手術(shù)后顱內(nèi)細(xì)菌性感染常見致病細(xì)菌MLPA檢測方法，采用上述探 針以待檢樣品的DNA為模板進(jìn)行雜交。
[0027] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，還包括采用一對通用引物對雜交后連接起來的 左側(cè)探針LPO和右側(cè)探針RPO進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述通用引物的上游引物和下游引物分別含 有SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38所示的序列。
[0028] -種神經(jīng)外科手術(shù)后顱內(nèi)細(xì)菌性感染常見致病細(xì)菌MLPA檢測試劑盒，包括上述 探針。
[0029] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，還包括一對通用引物，所述通用引物的上游引 物和下游引物分別含有SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38所示的序列。
[0030] 進(jìn)一步優(yōu)選的，還包括Ligase_65、Ligase buffer、Probe Mix和PCR Primer Mix， 其中，
[0031] Ligase-65 的配方為：lU/yL，其儲存液為 20mM Tris，pH 7.5,50mM KCl，lmM DTT， 0· ImM EDTA 和 50% (v/v)甘油；
[0032] Ligase buffer 的配方為：10XLigation Buffer :400mM Tris，pH 7. 8, IOOmM MgCl2, IOOmM DTT,5mM ATP ；
[0033] Probe Mix的配方為：每個(gè)探針的濃度為4fM，工作液為IOmM Tris-Cl, pH 8. 0, ImM EDTA ；
[0034] PCR Primer Mix的配方為：含有所述通用引物的上游引物和下游引物，每個(gè)引物 的濃度為10pM，上游引物為Cy 5.0標(biāo)記，dNTPs 2. 5mM，工作液為IOmM Tris-Cl, pH 8.0， ImM EDTA。
[0035] 本發(fā)明的有益效果是：
[0036] 本發(fā)明依據(jù)MLPA技術(shù)研發(fā)，能一次、快速診斷神經(jīng)外科手術(shù)后顱內(nèi)細(xì)菌性感染17 種常見致病細(xì)菌，為此類病人致病菌的快速診斷提供了可能，有助于降低此類感染的致死 率和致殘率。
【附圖說明】
[0037] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例5中PrbX的克隆之前PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖（以檢測1 號微生物腦膜炎奈瑟氏菌的右側(cè)探針RPO Prbl為例，PCR擴(kuò)增長度為165bp);
[0038] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例5中噬菌體顆粒懸液PCR驗(yàn)證的電泳圖（以檢測1號微生物 腦膜炎奈瑟氏菌的右側(cè)探針RPO Prbl為例，PCR擴(kuò)增長度為278bp);
[0039] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例5中噬菌體顆粒懸液PCR產(chǎn)物測序驗(yàn)證結(jié)果（以檢測1號微 生物腦膜炎奈瑟氏菌的右側(cè)探針RPO Prbl為例）；
[0040] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例6中右側(cè)長探針RPO的制備過程；
[0041] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例6中PrbX-M13 ssDNA電泳結(jié)果圖（以檢測1號微生物腦膜 炎奈瑟氏菌的右側(cè)探針RPO Prbl為例）；
[0042] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例6中PrbX-M13 ssDNA溶液酶切產(chǎn)物電泳分析圖（以檢測1 號微生物腦膜炎奈瑟氏菌的右側(cè)探針RPO Prbl為例）；
[0043] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例7中單靶點(diǎn)PrbX MLPA驗(yàn)證電泳圖（以檢測1號微生物腦膜 炎奈瑟氏菌的右側(cè)探針RPO Prbl為例，MLPA檢測到的長度為144bp);
[0044] 圖8為本發(fā)明實(shí)施例7中GeneScan? - 600LIZ Size Standard毛細(xì)管電泳圖；
[0045] 圖9為本發(fā)明實(shí)施例7中PrbX的MLPA反應(yīng)毛細(xì)管電泳結(jié)果（以檢測1號微生物 腦膜炎奈瑟氏菌的右側(cè)探針RPO Prbl為例，MLPA檢測到的長度為144bp);
[0046] 圖10為本發(fā)明實(shí)施例8中17個(gè)靶點(diǎn)的MLPA反應(yīng)毛細(xì)管電泳結(jié)果圖；
[0047] 圖11為本發(fā)明實(shí)施例9中利用PrbX(以17號微生物流感嗜血桿菌陽性標(biāo)準(zhǔn)品 質(zhì)粒為例）檢測不同稀釋濃度的含Prbl7流感嗜血桿菌靶點(diǎn)DNA的質(zhì)粒的MLPA檢測電泳 圖（M，DL 1000DNA Marker ;1-10,分別把檢測模板稀釋 1，101，102, 103, 104, 105, 106, 107, 108， 109,101°倍，MLPA檢測到的長度為512bp);
[0048] 圖12為本發(fā)明實(shí)施例9中（以17號微生物流感嗜血桿菌陽性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為例） 模板檢測限度重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（A，模板IO 8稀釋MLPA電泳圖；B 10 7倍稀釋MLPA反應(yīng)電泳 檢測圖；1-20, 20個(gè)重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)，MLPA檢測到的長度為512bp);
[0049] 圖13為本發(fā)明實(shí)施例9中PrbX探針（以17號微生物流感嗜血桿菌右側(cè)探針 Prbl7為例）不同濃度梯度稀釋后MLPA反應(yīng)凝膠電泳圖（M，DL1000DNA Marker ;1-8,探針 做1，101，102, 103, 104, 105, 106, 107, IO8濃度梯度稀釋，檢測到的長度為512bp);
[0050] 圖14為本發(fā)明實(shí)施例9中PrbX (以17號微生物流感嗜血桿菌右側(cè)探針Prbl7為 例）IO3和10 4濃度梯度稀釋20平行重復(fù)反應(yīng)結(jié)果（A，10 4稀釋重復(fù)；B，10 3稀釋重復(fù)；M，DL 1000DNA Marker ; 1-20, 20個(gè)重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)，MLPA檢測到的長度為512bp);
[0051] 圖15為本發(fā)明實(shí)施例10中以探針PrbUl號微生物腦膜炎奈瑟氏菌，檢測到的長 度分別為144bp)、Prb8(8號微生物粘質(zhì)沙雷氏菌，檢測到的長度分別為271)和Prbl7(17 號微生物流感嗜血桿菌右側(cè)探針Prbl7,檢測到的長度分別為512bp)短、中、長三個(gè)長度的 探針為例，重復(fù)性能檢測凝膠電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0052] 以下通過【具體實(shí)施方式】結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明和描述。
[0053] 實(shí)施例1顱內(nèi)感染致病菌的檢測靶點(diǎn)設(shè)計(jì)
[0054] 首先總結(jié)了神經(jīng)外科手術(shù)后顱內(nèi)細(xì)菌性感染常見致病菌，見表1 :
[0055] 表1.顯示神經(jīng)外科手術(shù)后顱內(nèi)細(xì)菌性感染常見致病菌匯總

[0058] 原則上，顱內(nèi)感染致病菌的檢測靶點(diǎn)的確定流程：進(jìn)入PubMed查找對每種致病菌 特異性的保守序列，如看家基因16S rRNA、rpoB、gyrB或ITS的序列，如表2所示：
[0059] 表2.神經(jīng)外科手術(shù)后顱內(nèi)細(xì)菌性感染常見致病菌的檢測靶點(diǎn)
[0061] 實(shí)施例2 MLPA探針雜交靶點(diǎn)的參考序列
[0062] 通過Blast工具分