一種基于三重放大反應(yīng)串聯(lián)的恒溫指數(shù)放大技術(shù)及其在microRNA檢測中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子檢測領(lǐng)域，具體涉及一種基于三重放大反應(yīng)串聯(lián)的恒溫指數(shù)放大 技術(shù)及其在microRNA檢測中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] MicroRNA (miRNA)是一種長度為18-23個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存 在于病毒、植物和高等哺乳動物的細胞中，在動植物的發(fā)育、細胞生長分化和凋亡、脂肪代 謝等生命活動過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。MiRNA突變或異位表達與多種人類癌癥相關(guān)， 可起到腫瘤抑制基因或癌基因的功能，在癌癥的診斷和治療中可起重要作用。因此，建立快 速、準確、高選擇性和高靈敏度的miRNA檢測方法，對深入研究miRNA的功能和調(diào)控作用，以 及疾病的診治，藥物開發(fā)等均具有重要意義。然而，成熟的miRNA -般只有二十幾個堿基， 同族的miRNA之間通常只有一兩個堿基的差別，而且絕大部分miRNA在細胞內(nèi)的表達水平 比較低，為準確靈敏檢測miRNA提出嚴峻挑戰(zhàn)。
[0003] 當前，miRNA的常規(guī)檢測方法有Northern印跡法、微陣列法等。Northern印跡法 是最早被用于評價和定量檢測miRNA表達的方法，也是現(xiàn)在檢測miRNA表達水平最主要的 手段之一。雖然經(jīng)過多年的發(fā)展和改進，該方法仍然無法克服操作繁瑣、費時費力、靈敏度 低、樣品需要量大等不足。微陣列技術(shù)可實現(xiàn)高通量、多組分同時檢測，但其靈敏度和選擇 性較差，且實驗和儀器費用較高?；诰酆厦告湻磻?yīng)（PCR)的技術(shù)因其快速、簡單、靈敏的 優(yōu)點常用于微量核酸物質(zhì)的檢測，但由于需要依賴精確的熱循環(huán)控制儀器，不僅增加了檢 測成本，而且對于短鏈DNA引物的設(shè)計極其復(fù)雜，限制了其進一步應(yīng)用。因此，建立恒溫條 件下的擴增技術(shù)受到極大關(guān)注，也成為當前miRNA檢測技術(shù)發(fā)展的方向之一。
[0004] 近期，一系列基于恒溫靶序列循環(huán)的放大技術(shù)受到極大發(fā)展。李和徐提出利用核 酸內(nèi)切酶切割目標核酸/分子信標結(jié)合雙鏈中的分子信標，不斷釋放目標核酸的靶序列循 環(huán)方法。該方案能夠顯著放大信號，但由于核酸內(nèi)切酶只能識別特殊序列，限制其應(yīng)用于 廣泛的目標序列。隨后，基于核酸外切酶的更通用的靶序列循環(huán)方法被提出。核酸外切酶 III可以催化切割，并逐步消除單核苷酸3'羥基末端序列的雙鏈。該方法在實現(xiàn)信號放大 的同時克服了目標序列的限制。最近，基于核酸外切酶的二次酶放大技術(shù)（HQEA)被進一步 提出。該方法顯示了更高的信號放大能力，但由于核酸外切酶殘余的活性會切割分子信標， 引起高的背景信號，降低了信噪比。雖然可以通過將反應(yīng)溫度從37°C降低到4°C來抑制殘 余的外切酶活性，但分析時間必須從2小時延長到24小時。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了改善常規(guī)核酸分析中依賴PCR擴增技術(shù)導(dǎo)致的檢測成本高，引物的設(shè)計復(fù) 雜，測定假陽性率高的問題，解決現(xiàn)有恒溫靶序列循環(huán)技術(shù)檢測背景信號高，分析時間長的 限制，實現(xiàn)高效、快速、高靈敏的核酸恒溫分析目的。本工作通過設(shè)計一個特殊的頸環(huán)結(jié)構(gòu) 作為媒介體，觸發(fā)聚合-鏈置換反應(yīng)，形成靶序列循環(huán)，在短時間內(nèi)擴增產(chǎn)生大量短鏈DNA 片段，激活脫氧核酶（deoxyribozyme)，切割焚光底物，形成祀序列循環(huán)，恒溫指數(shù)放大反 應(yīng)，以及脫氧核酶催化反應(yīng)三重循環(huán)放大過程的串聯(lián)，建立更為高效、快速的恒溫指數(shù)放大 技術(shù)，并應(yīng)用于microRNA的超靈敏焚光檢測。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0007] -種基于三重放大反應(yīng)串聯(lián)的恒溫指數(shù)放大檢測試劑盒，其包括：
[0008] (1)發(fā)夾探針：包括5'端頸部、環(huán)部與3'端頸部，環(huán)部與待檢核酸序列互補，3'端 頸部延伸至少2nt堿基作為恒溫指數(shù)擴增模板區(qū)，恒溫指數(shù)擴增模板區(qū)含有切口酶識別位 占.
[0009] (2)恒溫指數(shù)擴增引物：包括5'端序列和3'端序列，3'端序列與發(fā)夾探針的恒溫 指數(shù)擴增模板區(qū)互補；
[0010] (3)脫氧核酶：從5'至3'依次包括啟動區(qū)與催化區(qū)；啟動區(qū)為發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其環(huán)部 與恒溫指數(shù)擴增引物的5'端序列相同，3'端頸部至少有6個堿基與脫氧核酶底物序列互 補；催化區(qū)為錘頭狀核酶，其3'端至少有6個堿基與脫氧核酶底物序列互補；
[0011] ⑷脫氧核酶底物：其5'端和3'端分別標記有熒光和淬滅基團，中部含有1個核 糖核苷酸，核糖核苷酸兩端的序列分別與脫氧核酶啟動區(qū)的3'端頸部、催化區(qū)的3'端互 補。
[0012] 作為優(yōu)選的，所述核糖核苷酸為腺嘌呤核糖核苷酸。
[0013] 作為優(yōu)選的，所述發(fā)夾探針的頸部長6_8bp。
[0014] 作為優(yōu)選的，所述擴增引物的5'端至少有15nt與脫氧核酶的環(huán)部相同。
[0015] 作為優(yōu)選的，所述試劑盒中還包括：
[0016] (1)切口酶：其可識別發(fā)卡探針中的切口酶識別位點，并進行切割形成切口；
[0017] (2) DNA 聚合酶。
[0018] 進一步優(yōu)選的，所述試劑盒中還包括：dNTP、Mg2+。
[0019] -種miR_27a的恒溫指數(shù)放大檢測試劑盒，其包括：
[0020] (1)發(fā)夾探針：5' -TTGACTCGCGGAACTTAGCCACTGTGAAGAGTCAAAT-3' ；
[0021] (2)恒溫指數(shù)擴增引物：5'-TTGTTATCACCTATGATTTGACTC-3' ；
[0022] (3)脫氧核酶：5'-AAGAGAGTTGTTATCACCTATGCTCTCTTCAGCGATCCGGAACGGCACCCATG TTAG TGA-3，；
[0023] (4)脫氧核酶底物：5' -TAMRA-TCA CTATrAGGAA GAG-BHQ2-3'，rA 表示腺嘌呤核糖 核苷酸。
[0024] 作為優(yōu)選的，所述miR_27a恒溫指數(shù)放大檢測試劑盒中還包括切口酶、DNA聚合 酶。
[0025] 作為優(yōu)選的，所述切口酶為Nt. BstNBI切口酶。
[0026] 一種miRNA的檢測方法，包括如下步驟：
[0027] (1)將發(fā)卡探針、dNTP、恒溫指數(shù)擴增引物混合制成A反應(yīng)液，將A反應(yīng)液于80~ 95 °C下溫育5~8分鐘，然后冷卻至50~55 °C ;
[0028] (2)將待檢樣品、切口酶、DNA聚合酶混合制成B反應(yīng)液，加到步驟（1)的混合物 中，50~55 °C下溫育50~60分鐘；
[0029] (3)將Mg'脫氧核酶和脫氧核酸酶底物混合制成C反應(yīng)液，加到步驟⑵的混合 物中，混勻；
[0030] (4)檢測步驟⑶混合物的熒光強度，根據(jù)建立的標準曲線計算待檢樣品中目標 miRNA的含量；
[0031] 所述發(fā)卡探針、擴增引物、脫氧核酶、脫氧核酶底物的序列組成如上所述。
[0032] 作為優(yōu)選的，各反應(yīng)液的組成如下：
[0033] A反應(yīng)液中含有：0. 1 μ M發(fā)夾探針，250 μ MdNTP，40nM恒溫指數(shù)擴增引物， 0. 8U · yL 1RNA酶抑制劑；
[0034] B反應(yīng)液中含有：待測miRNA樣品，0· 5XNt. BstNBI緩沖液，IXThermoPol緩沖 液，0· 4U · μ L 1Nt. BstNBI 切 口酶，0· 32U · μ L 1Bst DNA 聚合酶；
[0035] C反應(yīng)液含有：2mM Mg2+，2 μ M脫氧核酸酶底物，1 μ M的脫氧核酶；
[0036] A、B、C反應(yīng)液的添加體積比為：10 :15 :5。
[0037] 本發(fā)明中各核酸探針的設(shè)計原理如下：
[0038] 1、發(fā)卡探針的設(shè)計：根據(jù)待測miRNA的序列設(shè)計發(fā)夾型探針（如圖1所示）。探 針環(huán)部序列與待測miRNA完全互補；3'端頸部延伸出至少2nt的堿基作恒溫指數(shù)擴增模板 區(qū)，其包含切口酶的識別序列。
[0039] 2、恒溫指數(shù)擴增引物的設(shè)計：恒溫指數(shù)擴增引物的結(jié)構(gòu)見圖2,恒溫指數(shù)擴增引 物的3'端的序列與發(fā)卡探針的恒溫指數(shù)擴增模板區(qū)互補；5'端的序列與脫氧核酶啟動區(qū) 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)部相同。
[0040] 3、脫氧核酶：其具有RNase酶活性，可以水解具有RNA核苷酸的底物，結(jié)構(gòu)如圖3 所示，包括啟動區(qū)與催化區(qū)，啟動區(qū)環(huán)部與擴增引物的5'端序列相同，3'端頸部與底物序列 互補，定義為底物結(jié)合位點1 ;催化區(qū)的3'端序列也與底物序列互補，定義為底物結(jié)合位點 2 ;