一種甲烷氧化菌豐度的自動(dòng)化檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及油氣與天然氣水合物勘探及油氣與天然氣水合物藏表征技術(shù)領(lǐng)域，更 具體地，涉及一種甲烷氧化菌豐度的自動(dòng)化檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中國(guó)是一個(gè)能源消耗大國(guó)。2013年我國(guó)石油的對(duì)外依存度接近60%。隨著工業(yè) 化和城鎮(zhèn)化進(jìn)程的加快，我國(guó)對(duì)油氣與水合物能源的需求進(jìn)入持續(xù)增長(zhǎng)期。我國(guó)雖然正在 實(shí)施節(jié)能減排和新能源發(fā)展戰(zhàn)略，但是在相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)我國(guó)仍然無(wú)法擺脫對(duì)油氣資源的依 賴，因此我國(guó)能源安全已被提上重要日程。為緩解我國(guó)能源緊張局面，加大力度勘探和更加 高效地開(kāi)發(fā)油氣與水合物迫在眉睫，而高效的勘探方法及其配套裝備的是解決能源需求的 關(guān)鍵途徑之一。
[0003] 油氣和水合物勘探領(lǐng)域包含地質(zhì)勘探、地球物理勘探、地球化學(xué)勘探和微生物勘 探四大核心技術(shù)。其中前三種勘探技術(shù)相對(duì)微生物油氣與水合物勘探技術(shù)而言已趨于成 熟。微生物勘探屬油氣和天然氣水合物勘探領(lǐng)域四大核心技術(shù)之一，是依據(jù)地表土壤/沉 積物/水中微生物異常進(jìn)行能源潛力評(píng)價(jià)的重要方法。微生物勘探技術(shù)因其快速、經(jīng)濟(jì)、結(jié) 果易解釋等優(yōu)勢(shì)而倍受學(xué)界的關(guān)注。微生物勘探方法具有快速、經(jīng)濟(jì)和結(jié)果易解釋等優(yōu)勢(shì)。 然而，因土壤、沉積物和水體中99%以上微生物不可培養(yǎng)，故基于培養(yǎng)法而建立的傳統(tǒng)微生 物勘探方法在檢測(cè)精度上很難滿足勘探要求；因氣態(tài)烴微滲漏是動(dòng)態(tài)和不連續(xù)的，故傳統(tǒng) 微生物勘探方法無(wú)法在微裂隙處于擠壓狀態(tài)的區(qū)塊發(fā)現(xiàn)氣態(tài)烴微滲漏；采用單一的活菌異 常指標(biāo)難以在現(xiàn)今沙漠、戈壁和海洋深水等環(huán)境開(kāi)展勘探；傳統(tǒng)微生物勘探方法用于油氣 藏表征時(shí)需兩次采樣，這不僅顯著增加成本，且在很多開(kāi)采區(qū)無(wú)法實(shí)施，因我國(guó)多數(shù)油氣藏 未開(kāi)展過(guò)微生物表征。
[0004] 微生物油氣與水合物勘探技術(shù)的不成熟性主要表現(xiàn)在：（1)面對(duì)豐度很低、對(duì)油 氣具有指示意義的、專性或兼性微生物的復(fù)雜樣品，基于微生物培養(yǎng)法而建立的傳統(tǒng)微生 物油氣勘探技術(shù)，不僅很難測(cè)準(zhǔn)其微生物豐度（因?yàn)橥寥篮统练e物中99%以上的微生物不 可培養(yǎng)），數(shù)據(jù)可靠性差；（2)無(wú)法發(fā)現(xiàn)微裂隙處于擠壓狀態(tài)的勘探區(qū)油氣與水合物藏；（3) 面對(duì)復(fù)雜多樣的油氣與水合物勘探區(qū)，特別是沙漠、戈壁、鹽堿地和海洋深水區(qū)，基于微生 物培養(yǎng)法而建立的傳統(tǒng)微生物油氣與水合物勘探技術(shù)基本失效；究其原因，主要是傳統(tǒng)微 生物油氣與水合物勘探技術(shù)僅依賴于單指標(biāo)的活菌異常；(4)基于培養(yǎng)法的傳統(tǒng)油氣與水 合物勘探技術(shù)對(duì)樣品的處理效率非常低，通常一批樣品至少需要14天才能獲得結(jié)果，周期 長(zhǎng)，效率低，成本高；（5)數(shù)據(jù)影響因素多、波動(dòng)大，在分析測(cè)定流程中會(huì)引入大量的人為誤 差；檢測(cè)流程不可追溯，且無(wú)法進(jìn)行系統(tǒng)誤差的校正。
[0005] 王江海等基于微生物單細(xì)胞和基因的原態(tài)檢測(cè)技術(shù)，率先提出原態(tài)微生物油氣與 水合物勘探技術(shù)的概念、原理和技術(shù)方案，并在甲烷氧化菌活菌體外特異性熒光染色、甲 烷-丁烷氧化菌死菌和活菌的快速定量檢測(cè)、微生物油氣勘探多重指標(biāo)的設(shè)立和油氣田區(qū) 微生物群落變性梯度凝膠電泳分析的PCR策略等方面取得重要進(jìn)展，形成以氣態(tài)烴氧化菌 及其關(guān)聯(lián)菌類的活菌、死菌和總菌異常為多重勘探指標(biāo)的微生物油氣與水合物勘探技術(shù)， 但目前仍然需要用手工方法檢測(cè)微生物豐度，無(wú)法根本性解決微生物油氣與水合物勘探技 術(shù)的缺陷。
[0006] 原態(tài)微生物油氣與水合物勘探技術(shù)（IsMOST)是基于現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的油氣 與水合物勘探技術(shù)，只有實(shí)現(xiàn)低豐度微生物樣品的大批量快速處理，以及在配套裝備技術(shù) 領(lǐng)域取得根本性的突破的基礎(chǔ)上，才有可能真正將原態(tài)微生物勘探技術(shù)運(yùn)用于油氣和水合 物勘探方面。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有微生物油氣與水合物勘探技術(shù)的不足， 尤其是自動(dòng)化樣品處理技術(shù)不足，提供一種定量檢測(cè)甲烷氧化菌豐度的自動(dòng)化方法，基于 所述方法可實(shí)現(xiàn)低豐度微生物樣品的大批量快速處理和分析，并保證準(zhǔn)確的分析檢測(cè)結(jié) 果，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)流程的可追溯性和系統(tǒng)誤差的統(tǒng)一校正。
[0008] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0009] 提供一種檢測(cè)甲烷氧化菌豐度的自動(dòng)化樣品處理方法，包括以下步驟：
[0010] SI.構(gòu)建原態(tài)微生物油氣與水合物勘探技術(shù)的自動(dòng)化工作站（isMOST);所述工作 站包括自動(dòng)液體處理裝置、核酸提取設(shè)備、PCR反應(yīng)體系配置系統(tǒng)；
[0011] S2.樣品處理，從每個(gè)樣品中得到大于I. 5ml的上清液；
[0012] S3.采用本發(fā)明原態(tài)微生物油氣與水合物勘探工作站的自動(dòng)液體處理裝置 (isMOST Station 1)完成移液；具體是執(zhí)行自動(dòng)液體處理裝置設(shè)定的程序，將不同的試劑 通過(guò)自動(dòng)控制機(jī)械臂上移液通道和移液模塊的操作自動(dòng)加入對(duì)應(yīng)的樣品板、結(jié)合板、洗滌 板和洗脫板中；
[0013] S4.自動(dòng)核酸提取裝置提取與純化DNA，將所有的樣品板都準(zhǔn)備好后，執(zhí)行本發(fā)明 原態(tài)微生物油氣與水合物勘探工作站（isMOST Station 2)設(shè)定的程序，即可得土壤和/或 沉積物中的總基因組DNA。約1小時(shí)后，核酸提取與純化流程結(jié)束，將樣品的核酸提取液移 轉(zhuǎn)移至微量PCR管中，標(biāo)記清楚后于_20°C冰箱中保存；
[0014] S5.瓊脂糖電泳檢測(cè)；
[0015] 操作方法如下：
[0016] a.取5 μ I DNA提取液于1 %瓊脂糖上電泳鑒定，DNA Ladder為DL2000。
[0017] b.若有>2kbp條帶，則取5 μ I DNA提取液加滅菌水稀釋20倍后作為PCR模板并 在4°C下保存，樣品基因組DNA提取液保存于-20°C。
[0018] S6.甲烷氧化菌豐度的熒光定量PCR檢測(cè)
[0019] (1)甲烷氧化菌的培養(yǎng)
[0020] 配制甲烷氧化菌的培養(yǎng)基；將1%甲烷氧化菌接種于培養(yǎng)瓶中；密封后注入甲烷； 在適宜的溫度下培養(yǎng)15天，爾后轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，至肉眼可見(jiàn)培養(yǎng)液渾濁；收集培養(yǎng)所得的甲烷 氧化菌/ 丁烷氧化菌菌體，用于甲烷氧化菌的核酸提取及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。
[0021] (2)設(shè)計(jì)特異性引物
[0022] 根據(jù)甲烷氧化菌pmoA基因的CDS序列，設(shè)計(jì)并合成可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 甲烷氧化菌的特異性引物，引物序列如下：
[0023] F: 5，-CTGGCAGGGCATTCAGGATT-3 '
[0024] R: 5，-GAAGAAGGGCGTCAGCGTGT-3，
[0025] (3)制備標(biāo)準(zhǔn)品
[0026] 以總基因組DNA為模板，采用特異性引物擴(kuò)增甲烷氧化菌的目標(biāo)片段，且將其與 T載體連接；將連接產(chǎn)物加至感受態(tài)細(xì)胞懸液中，再提取質(zhì)粒；經(jīng)測(cè)序證實(shí)為甲烷氧化菌目 標(biāo)片段后，再測(cè)定質(zhì)粒DNA的純度并定量；最后用無(wú)菌雙蒸水稀釋至一定濃度，-20°C分裝 保存，作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0027] (4)建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件
[0028] 實(shí)時(shí)焚光定量 PCR 擴(kuò)增在 Roche Light Cycler 480 (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)中完成。反應(yīng)體系是根據(jù) SYBR_3? Premix Ex Taq?(TaKaRa)制造商說(shuō)明書制備。用特異引物擴(kuò)增甲烷氧化菌pmoA基因的⑶S序列。沉 積物中總基因 DNA以1~IOng的水平作為模板加入每個(gè)反應(yīng)混合物中。按照表2配制PCR 反應(yīng)體系。
[0029] 表2 PCR反應(yīng)體系配方
[0030]
[0031] 用無(wú)菌CldH2O代替DNA作為陰性對(duì)照。操作過(guò)程均在冰浴中進(jìn)行。采用 LightCycler480 Software 1. 5. 0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
[0032] RT-PCR 反應(yīng)條件：
[0034] 其中，PCR反應(yīng)體系的配制在本發(fā)明原態(tài)微生物油氣與水合物勘探工作站（isMOST Sta