一種抑制nema從頭dna合成現(xiàn)象的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)等溫檢測領(lǐng)域，具體涉及一項(xiàng)抑制切克內(nèi)切酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò) 增從頭DNA合成現(xiàn)象的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 最早的從頭合成的概念指的是生物體內(nèi)用簡單的前體物質(zhì)合成生物分子的途 徑。通常大家熟知的是：游離的堿基和自由的核苷經(jīng)過簡單反應(yīng)合成是核苷酸合成的主 要來源，此過程稱為重新利用（或者補(bǔ)救合成）途徑（Salvage Pathway)。早在1948年， Buchanan等采用同位素示蹤技術(shù)搞清楚了嘌呤核苷酸的在鴿子體內(nèi)的合成過程，即為補(bǔ)救 合成途徑。然而，體內(nèi)最主要的核苷酸合成途徑是從頭合成途徑（de novo synthesis):氨 基酸、核糖核苷、一碳單位以及二氧化碳等簡單物質(zhì)做為原料合成核苷酸的復(fù)雜轉(zhuǎn)變過程。
[0003] 切刻內(nèi)切酶具有高度的酶切活性，加上鏈置換活性強(qiáng)的Bst DNA聚合酶的參 與，Nadezhda V. Zyrina等在2007年的實(shí)驗(yàn)中同時(shí)使用了該兩種酶并提出了兩種酶能夠 參與催化"de novo synthesis"的觀點(diǎn)。研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把N.BspD6I DNA切刻內(nèi)切酶 (-GAGTCNNNN-)加入到）加入到含有dNTP和Bst DNA大片段聚合酶的混合體系中時(shí)，即是 不存在模板和引物的情況下，大量的DNA合成物也會產(chǎn)生。而且，N.BspD6I DNA切刻內(nèi)切 酶的活性同"從頭DNA"的大量合成是呈正相關(guān)性的，在其最大活性值時(shí)，"從頭DNA"的量達(dá) 到最大濃度。電子顯微鏡數(shù)據(jù)顯示，大多數(shù)從頭合成的DNA分子有一個(gè)分支結(jié)構(gòu)，而且包括 大量短的重復(fù)序列，像是真核細(xì)胞中的隨行DNA，這些序列顯示了含有4-36bp的重復(fù)長度 的準(zhǔn)回文結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)通過合成片段的克隆和排序證實(shí)了從頭合成的DNA產(chǎn)物主要是由多重 的六核苷酸非回文串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)構(gòu)成，這個(gè)結(jié)構(gòu)中包含有多處切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)。一 種可能的機(jī)理就是：dNTP原料依賴的DNA合成物是由N. BspD6I DNA切刻內(nèi)切酶激發(fā)產(chǎn)生 的。它來源于一個(gè)"消化-延長"的高效的指數(shù)擴(kuò)增的循環(huán)：包含有多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的 回文結(jié)構(gòu)的DNA鏈被消化為短片段，這些短片段作為模板用于延伸出更長的DNA產(chǎn)物。
[0004] 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在一種嗜熱限制性內(nèi)切酶（普遍為切刻內(nèi)切酶）存在時(shí)，即使不添加 任何的模板和引物核苷酸的情況下，嗜熱的DNA聚合酶在恒溫條件下便會高效合成和擴(kuò)增 DNA。1個(gè)小時(shí)內(nèi)IM的DNA聚合酶能夠合成超過10 μ g的DNA，而且這個(gè)反應(yīng)會持續(xù)到可 獲得的dNTP消耗完為止。另有文章提出，Bst大片段DNA聚合酶在N. BspD61切刻內(nèi)切酶 和dNTP存在時(shí)表現(xiàn)出一種十分高效的模板依賴的DNA合成性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還表明，IOM的 N. BspD61切刻酶添加量條件下> 200bp的DNA產(chǎn)物主要是在1小時(shí)恒溫中合成的，反而隨 著恒溫時(shí)間的增長會導(dǎo)致短片段（< 200bp)的積累。"從頭DNA"能夠在55-75°C溫度范圍 內(nèi)合成，最佳溫度范圍是65-70°C。在較低溫度時(shí)（< 60°C )，反應(yīng)相對減慢而且合成的是 較長的DNA分子（> Iknt);在較高溫度時(shí)（> 75°C )，少量的（或者是幾乎沒有）DNA合 成。
[0005] 切刻內(nèi)切酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Nicking-mediated isothermal amplification, NEMA)是依賴切刻內(nèi)切酶和鏈置換DNA聚合酶的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在分子生物檢測領(lǐng)域， 尤其是現(xiàn)場快速檢測領(lǐng)域具有強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。然而NEM技術(shù)中不可避免地存在從頭 DNA合成現(xiàn)象，這一現(xiàn)象對擴(kuò)增結(jié)果的判斷具有干擾作用。專利200610057262. 7中介紹 了 NEM的相關(guān)技術(shù)，但沒有針對NEM從頭DNA合成現(xiàn)象的抑制研究，其余關(guān)于等溫?cái)U(kuò)增 反應(yīng)體系優(yōu)化也沒有對這一現(xiàn)象的研究（詳見專利201180035890. 4,201210179864. 5， 200980145201. 8)，因此需要尋找新的反應(yīng)體系或增強(qiáng)劑能夠顯著提高NEMA的可信度。
[0006] 甜菜堿作為一種核酸擴(kuò)增增強(qiáng)劑，最常參與推進(jìn)的等溫反應(yīng)便是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 技術(shù)（LAMP)。甜菜堿可以減少堿基堆積，抑制核酸二級結(jié)構(gòu)的形成，從而維護(hù)正常的擴(kuò)增 秩序促進(jìn)DNA擴(kuò)增效率。即便是高濃度的甜菜堿對多種酶及其他生物大分子也不會產(chǎn)生 大的影響，甚至有保護(hù)作用。海藻糖由于其特有的物理和化學(xué)性質(zhì)導(dǎo)致了它特有的抗性作 用，該作用使其具有異常的水合能力、對環(huán)境變化的質(zhì)構(gòu)敏感性，所以海藻糖對生物大分子 具有良好的保護(hù)作用，能夠在較高溫度下穩(wěn)定酶的空間構(gòu)象，提高酶的熱穩(wěn)定性。此前曾有 研究利用海藻糖提高某些核酸內(nèi)切酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)溫度，從而在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（Reverse transcription)的中合成更長的目的互補(bǔ)鏈。對于兩種酶存在的NEMA體系，海藻糖還能夠 有效縮短兩種酶最適反應(yīng)的溫度差，從而輔助NEM完成高效的等溫?cái)U(kuò)增過程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 切克內(nèi)切酶為該等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的特征酶，切刻內(nèi)切酶是一種限制性內(nèi)切酶，它能 夠識別特異性的核苷酸序列，并且在序列內(nèi)部或首尾處發(fā)生單鏈切割；該過程對底物DNA 沒有要求，即不需要有任何化學(xué)修飾。與常見的核酸內(nèi)切酶相同，切刻內(nèi)切酶也通過辨認(rèn)特 異的核苷酸序列來切割雙鏈DNA的特定位點(diǎn)。切刻內(nèi)切酶的特點(diǎn)是：并不同時(shí)切斷核酸雙 鏈，而只是根據(jù)特異的位點(diǎn)序列選擇切斷雙鏈中的一條鏈。
[0008] 常用的切克內(nèi)切酶包括 Nb. BsaI, Nb. BspD6I, Nt. Bst9I, Nb. BstNBI, Nb. BspQI, Nb. BsrDI等。他們所識別序列的堿基數(shù)目由4到7個(gè)不等。
[0009] 切克內(nèi)切酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（Nicking Enzyme Mediated Amplification， NEM)是在SDA的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的不依賴于特殊化學(xué)修飾的等溫方法。反應(yīng)體系中使用 的切克內(nèi)切酶（又稱為切口酶），是一種能夠識別特異性的位點(diǎn)并發(fā)生自然單鏈切割產(chǎn)生 缺口的酶，切克內(nèi)切酶的這種功能克服了傳統(tǒng)SDA反應(yīng)中需要添加化學(xué)修飾的非標(biāo)準(zhǔn)核苷 酸的缺陷，簡化了反應(yīng)體系提高了反應(yīng)效率。切克內(nèi)切酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的基本原 理分為"切割單鏈形成切口"和"鏈置換剝離舊鏈"兩個(gè)過程。NEMA的反應(yīng)體系包括兩對引 物（剝離引物B/B 2，切割引物S/S2)、一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶、一種能夠識別特 異性切割位點(diǎn)的切克內(nèi)切酶、額外添加的鎂離子以及適宜的緩沖溶液。
[0010] PCR反應(yīng)的增強(qiáng)劑的作用是從增加特異產(chǎn)物和減少非特異產(chǎn)物兩個(gè)方面入手，提 高反應(yīng)的擴(kuò)增效率。目前PCR體系中嘗試使用過許多核酸擴(kuò)增增強(qiáng)劑，其原理各不相同，當(dāng) 然也各自適用于不同的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中。根據(jù)其作用和原理，核酸擴(kuò)增增強(qiáng)劑可以大致分 為三類：（1)參與高GC%含量，易形成復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的模板（共溶劑）體系（2)保護(hù)DNA聚 合酶的活性和穩(wěn)定性（3)優(yōu)化引物和模板的退火。借鑒其他的等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)的體系， NEM的反應(yīng)增強(qiáng)劑應(yīng)該選擇保護(hù)DNA聚合酶的活性和穩(wěn)定性和優(yōu)化引物和模板的結(jié)合兩 個(gè)方面的。
[0011] 海藻糖由于其特有的物理和化學(xué)性質(zhì)導(dǎo)致了它特有的抗性作用，該作用使其具有 異常的水合能力、對環(huán)境變化的質(zhì)構(gòu)敏感性，所以海藻糖對生物大分子具有良好的保護(hù)作 用，能夠在較高溫度下穩(wěn)定酶的空間構(gòu)象，提高酶的熱穩(wěn)定性。有人曾利用海藻糖提高某些 核酸內(nèi)切酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)溫度，從而在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（Reverse transcription)的中合 成更長的目的互補(bǔ)鏈。對于兩種酶存在的NEM體系，海藻糖還能夠有效縮短兩種酶最適反 應(yīng)的溫度差，從而輔助NEM完成高效的等溫?cái)U(kuò)增過程；甜菜堿作為一種核酸擴(kuò)增增強(qiáng)劑， 最常參與推進(jìn)的等溫反應(yīng)便是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP)。甜菜堿可以減少堿基堆積，抑 制核酸二級結(jié)構(gòu)的形成，從而維護(hù)正常的擴(kuò)增秩序促進(jìn)DNA擴(kuò)增效率。有研究表明，即便是 高濃度的甜菜堿對多種酶及其他生物大分子也不會產(chǎn)生大的影響，甚至有保護(hù)作用。
[0012] 本發(fā)明提供一種抑制切克內(nèi)切酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增從頭DNA合成的方法，所述方法包 括以下步驟：
[0013] (1)合理添加 Nt. BstNBI切克內(nèi)切酶和dNTP，特別添加海藻糖、甜菜堿在原有反應(yīng) 體系中；
[0014] (2)擴(kuò)增反應(yīng)溫度58-60°C，反應(yīng)時(shí)間Ih ;
[0015] (3)通過凝膠電泳判斷抑制效果。
[0016] 切克內(nèi)切酶及其用量的選擇是在若干種商業(yè)化切克內(nèi)切酶中選擇產(chǎn)生的。不同切 克內(nèi)切酶對反應(yīng)中從頭DNA合成現(xiàn)象的貢獻(xiàn)不同，這與其特異性識別位點(diǎn)有關(guān)，還與其識 別位點(diǎn)的長度有關(guān)；抑制從頭DNA合成現(xiàn)象明顯的切克內(nèi)切酶不一定對擴(kuò)增反應(yīng)有利，選 擇Nt. BstNBI是在考慮抑制從頭DNA合成現(xiàn)象與擴(kuò)增反應(yīng)的綜合決定。使用Nt. BstNBI的 反應(yīng)非特異帶狀彌散大多出現(xiàn)在1500bp以上，能夠與目的產(chǎn)物明顯的區(qū)分，可清除的判別 擴(kuò)增情況。
[0017] 添加海藻糖和甜菜堿的作用為提高擴(kuò)增效率，抑制非特異擴(kuò)增，減少堿基堆積，抑 制核酸二級結(jié)構(gòu)形成。
[0018] 該方法使用凝膠電泳判斷抑制效果，若泳道背景信號顯著減弱，則證明該方法能 夠成功抑制從頭DNA合成現(xiàn)象。
[0019] 本發(fā)明還設(shè)計(jì)關(guān)于抑制切克內(nèi)切酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增從頭DNA合成現(xiàn)象的試劑盒，主 要包括以下試劑：
[0020] dNTP，海藻糖，甜菜堿的預(yù)混液；
[0021] Nt. BstNBI 切克內(nèi)切酶。
[0022] 該試劑盒的使用方法如下：
[0023] (1)合理添加 Nt. BstNBI切克內(nèi)切酶至預(yù)混液中，共同加入原有原有反應(yīng)體系中；
[0024] (2)擴(kuò)增反應(yīng)溫度58-60°C，反應(yīng)時(shí)間40min-lh ;
[0025] (3)通過凝膠電泳判斷抑制效果。
[0026] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的有益效果：
[0027] 本發(fā)明從方法學(xué)角度對切克內(nèi)切酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增進(jìn)行優(yōu)化，通過優(yōu)化切克內(nèi)切酶 及添加其他反應(yīng)增強(qiáng)劑，擴(kuò)增過程中的從頭DNA合成現(xiàn)象受到極大抑制，大大增加了該等 溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的可信度。該方法簡單實(shí)用，可操作性行強(qiáng)，大大降低電泳檢測的背景信號，為 切克內(nèi)切酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增提供了改進(jìn)的空間。
【附圖說明】
[0028] 圖1為不同切克內(nèi)切酶的從頭DNA合成效果圖。從左至右依次為Nb. BbvCI， Nt. BspQI，Nt. BstNBI，Nt. BsrDI D
[0029] 圖2為不同切克內(nèi)切酶的NEMA。從左至右依次為Nb. BbvCI，Nt. BspQI，Nt. BstNBI， Nt. BsrDI0
[0030] 圖3 (a)為添加甜菜堿前后的NEM ;圖3 (