鑒別布魯氏菌a19疫苗株與野毒株的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒別布魯氏菌A19疫苗株與野毒株的試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 布魯氏菌?。˙rucellosis)是由布魯氏菌屬細(xì)菌引起的一種廣泛分布于世界各 地的人畜（獸）共患傳染病，其不僅影響畜牧業(yè)的健康發(fā)展而且危害人類公共衛(wèi)生健康。 根據(jù)國家衛(wèi)計(jì)委公布的全國法定傳染病疫情數(shù)據(jù)，2014年我國人感染布魯氏菌病人數(shù)為 57222,發(fā)病率比2013年增長了 31. 48%。人感染布魯氏菌病的傳染源主要來源于感染的動 物及被污染的畜產(chǎn)品，因此，控制和消滅動物布魯氏菌病，是防止人類感染布魯氏病的根本 保障。
[0003] 目前疫苗免疫仍是控制動物布魯氏菌病的主要措施之一。當(dāng)前國外主要使用的布 魯氏菌疫苗株是牛種S19株和RB51株以及羊種Rev. 1株，這些疫苗株我國目前尚未引進(jìn)和 使用。我國使用的疫苗株主要是牛種布魯氏菌A19疫苗株和豬種布魯氏菌S2疫苗株，以前 還曾使用過羊種M5-90疫苗株，由于毒力問題現(xiàn)在暫時(shí)不再使用。A19疫苗株的使用為我國 動物群布魯氏菌病的防控提供了重要保障，該菌株是光滑型，其LPS含有0-側(cè)鏈，能持續(xù)刺 激機(jī)體產(chǎn)生抗體，對牛有一定的保護(hù)力，但是也存在著無法鑒別A19疫苗株與野毒感染株 的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸問題。雖然競爭ELISA(cELISA)和熒光偏振實(shí)驗(yàn)（FPT)以其高通量以及操 作方面的優(yōu)勢，在布魯氏菌弱毒疫苗與野生菌株感染的血清學(xué)鑒別有一定的應(yīng)用，但是對 未知背景的血清樣本來說，單次檢測仍不能確切分辨疫苗免疫或野毒感染。從病原學(xué)方面 鑒別診斷布魯氏菌野毒株核酸，可以準(zhǔn)確判斷動物體是否帶菌，為布魯氏菌病陽性動物的 檢疫淘汰提供技術(shù)支撐。因此，利用分子生物學(xué)方法，依據(jù)A19疫苗株與其他布魯氏菌毒株 基因組差異堿基序列，通過PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物序列測定，可有效實(shí)現(xiàn)A19疫苗株與野毒株 的分子鑒別，將其應(yīng)用于臨床鑒別，可以為我國A19疫苗株的鑒別提供技術(shù)保障。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明人通過基因組序列比對，發(fā)現(xiàn)與其他布魯氏菌屬細(xì)菌基因組DNA序列不同的 是，A19疫苗株在基因組22840位點(diǎn)處，即SEQ ID No. 3的344位點(diǎn)處，缺失7個核苷酸序 列，該位點(diǎn)后序列為AGATTTCAGA，其他布魯氏菌序列為AGATTTCAGATTTCAGA，因?yàn)榇颂帪?AGATTTC的重復(fù)序列，所以在序列比對時(shí)會出現(xiàn)兩種序列缺失現(xiàn)象（AGATTTC或TTTCAGA)。 在該缺失位點(diǎn)上下游處設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增后序列測定，序列比對以及測序峰圖的不 同就可以特異性鑒別牛種布魯氏菌A19疫苗株，以上是提出本發(fā)明的技術(shù)依據(jù)。
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種鑒別布魯氏菌A19疫苗株與野毒株的試劑盒及其使用 方法，該試劑盒能夠特異地鑒別臨床樣本中布魯氏菌A19疫苗株。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，采用如下技術(shù)方案：
[0007] 鑒別布魯氏菌疫苗株A19與野毒株的試劑盒，該P(yáng)CR試劑盒由PCR反應(yīng)液、DNA聚 合酶、陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品組成；
[0008] 所述PCR反應(yīng)液包括鑒定并測序A19疫苗株特異性核苷酸序列的引物對，其中鑒 別A19疫苗株的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No. 2所示，分 別如下：
[0009] SEQ ID No. 1 :5'-TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCA-3'
[0010] SEQ ID No. 2 :5'-GGCGGGCTGCATTCTTTACTCTGC-3'
[0011] 所述陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為牛種布魯氏菌A19疫苗株陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；
[0012] 所述牛種布魯氏菌A19疫苗株陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品由含有562個堿基的核苷酸片段構(gòu) 成的PEASY-T3重組質(zhì)粒組成。
[0013] 所述含有562個堿基的核苷酸片段的序列如SEQIDNo. 3所示：
[0014] SEQIDNo. 3 ：
[0015] 5'-TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCACCCTTTACCGTCGCATCATTGCAGACGATCATGCATTCG CGGCCCGATACGCGCCCGATGCCGGTGATGAAGCCAGCGGCGGGCGCTGCCCCGCCATACATGCCATGCGCTGCCGT CAGCCCCAGTTCCAGAAAGGGGGAACCCGGATCGAGCAATTGCGCCACGCGCTCACGGGGCAGAAGTTTTCCGCGCG AAACATGGCGGTCGCGCGCTTTCTCGCCGCCGCCGTCAATGGCAATGCGCGAGGCTTCCGCCACCACGTCGATTGCC GCCAGCATGGCCTTGCGGTTGGCCTCGAAGCTTGCGCTGCGCGTCGAGATTTCAGAACCGGCATCAACGGGTCTCCT GAAAGAGTTCCCGTCCGATCAGCATACGCCGGATTTCCGACGTGCCCGCGCCGATTTCATAAAGCTTGGCATCGCGC AAAAGGCGGCCCGTCGGATAATCGTTGATATAGCCGTTGCCGCCGAGAGACTGGATCGCCTGCAAGGCCATCTGCGT GGCATTTTCCGCAGAGTAAAGAATGCAGCCCGCC-3'
[0016] 所述PCR反應(yīng)液還包括含有dNTPs、Mg'雙蒸水的PCR緩沖液。
[0017] 所述含有562個堿基的核苷酸片段是從牛種布魯氏菌A19疫苗株中克隆得到。
[0018] 所述陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無菌雙蒸水（(IdH2O)。
[0019] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了鑒別布魯氏菌A19疫苗株與野毒株的PCR試劑盒的使用方 法，該方法的條件和步驟如下：
[0020] (1)提取待測樣本的基因組DNA ;
[0021 ] 所述待檢測的樣本為血液、奶樣、組織樣本、氣溶膠樣本等。
[0022] (2)以提取的樣本基因組DNA為模板，將樣本DNA、陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品和陰性質(zhì)控標(biāo) 準(zhǔn)品分別加入到含有PCR反應(yīng)液和DNA聚合酶的50 μ L體系的PCR反應(yīng)管中，按照經(jīng)過優(yōu) 化后的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，具體的反應(yīng)條件為：94°C 3min，94°C 30sec、60°C 30sec、 72°C 30sec，35 個循環(huán)，72°C IOmin;
[0023] 所述PCR反應(yīng)液由鑒定布魯氏菌A19疫苗株的引物對以及含有dNTPs、Mg'雙蒸 水的PCR緩沖液組成；
[0024] 所述引物對分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2,分別命名為A19-F和A19-R序列 如下：
[0025] 正向引物 A19-F :5' -TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCA-3'
[0026] 反向引物 A19-R :5' -GGCGGGCTGCATTCTTTACTCTGC-3'
[0027] 所述的PCR反應(yīng)體系為50 μ L，具體包括以下組份：
[0028]
[0029] (3)取50yL PCR產(chǎn)物，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，觀察鑒別牛種布魯氏 菌A19株引物對擴(kuò)增出562bp及與之大小對應(yīng)的條帶；本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知曉，在瓊脂糖凝 膠電泳檢測時(shí)，顯示與目的條帶大小對應(yīng)的條帶，意指PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小相近，因樣品來源 或目標(biāo)種屬不同，PCR產(chǎn)物大小會有較小差異，但顯示條帶對應(yīng)，例如相差30bp/20bp范圍 內(nèi)的條帶均顯示大小對應(yīng)。
[0030] (4)如果上述PCR檢測結(jié)果與目的條帶不符，則說明模板為布魯氏菌陰性，如果 PCR檢測條帶大小正確，則對陽性條帶進(jìn)行切膠回收純化，然后再進(jìn)行序列測定。
[0031] (5)鑒別布魯氏菌A19疫苗株的結(jié)果判定：使用A19-F引物對純化的562bp或與 之大小對應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行測序，如果測序結(jié)果峰圖為單一峰，與SEQIDNo. 3比對后完全匹配， 則該樣本為A19疫苗株；如果測序結(jié)果峰圖為單一峰，與SEQIDNo. 3比對后在第344位點(diǎn)處 多出7個核苷酸序列（AGATTTC或TTTCAGA)，則該樣本為除A19疫苗株以外的其他布魯氏菌 野毒株或疫苗株；如果測序結(jié)果與SEQIDNo. 3比對，在峰圖的序列第354位，即AGATTTCAGA 后出現(xiàn)套峰，則該樣本為A19疫苗株和其他布魯氏菌株混合。
[0032] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明了，上述鑒別方法，其直接目的是鑒別菌株種類，而非獲取 疾病診斷結(jié)果。
[0033] 本發(fā)明取得了以下效果：
[0034] (1)為我國A19疫苗株的鑒別提供新的技術(shù)手段；
[0035] (2)本發(fā)明所述引物對具有較高的特異性，通過擴(kuò)增-電泳檢測，可有效的區(qū)分布 魯氏菌和其他常規(guī)細(xì)菌菌株；
[0036] (3)本發(fā)明所述鑒別方法，有效地將布魯氏菌A19疫苗株與其他布魯氏菌野毒株 或疫苗株區(qū)分開來，具有極高的準(zhǔn)確率。
【附圖說明】
[0037] 圖I A19疫苗株缺失位點(diǎn)處上下游序列PCR擴(kuò)增，+ :模板為A19疫苗株陽性質(zhì)控 標(biāo)準(zhǔn)品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物562bp，-:模板為陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，1-5:模板分別為牛種布魯氏菌 疫苗株A19株、豬種布魯氏菌疫苗株S2株、羊種布魯氏菌疫苗株M5-90株、綿羊種布魯氏菌 63/290株、犬布魯氏菌RM6/66株基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物562bp ;6-10 :模板分別為大 腸桿菌0157:H7、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌0:9、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、牛分支桿菌基因組 DNA0
[0038] 圖2 A19疫苗株缺失位點(diǎn)處序列測定峰圖，A :測序峰圖為單一峰，與SEQ ID No. 3 比對后完全匹配，檢測模板為A19疫苗株。B :測序峰圖為單一峰，與SEQ ID No. 3比對后在 344位點(diǎn)處多出7個核苷酸序列（AGATTTC或TTTCAGA)，檢測模板為除A19疫苗株以外的其 他布魯氏菌野毒株或疫苗株。C :測序結(jié)果與SEQ ID No. 3比對，峰圖在序列第354位點(diǎn)后， 即AGATTTCAGA序列后出現(xiàn)套峰，檢測模板為A19疫苗株與其他布魯氏菌株的混合。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下述實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0040] 以下實(shí)施例均按照常規(guī)試驗(yàn)條件與方法進(jìn)行，或者按照制造廠商所建議的試驗(yàn)條 件。
[0041] 1.試驗(yàn)材料
[0042] 牛種布魯氏菌疫苗株A19株（B. abortus A19)，豬種布魯氏菌疫苗株S2株（B. suis S2)，羊種布魯氏菌疫苗株M5-90株（B. melitensis M5-90)，綿羊種布魯氏菌63/290株 (B. ovis 63/290)，犬布魯氏菌 RM6/66 株（B. canis RM6/66)，大腸桿菌 0157:H7、小腸結(jié) 腸炎耶爾森菌0:9、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌（CMCC256