一種用于檢測(cè)呼吸道病毒的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于核酸擴(kuò)增技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于檢測(cè)呼吸道病毒的試劑盒及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 呼吸道感染分為上呼吸道感染和下呼吸道感染，主要病原體包括細(xì)菌、病毒、支原 體、衣原體、真菌等，其中主要以病毒性感染為主，特別是上呼吸呼吸道感染中有80%以上 是病毒性的。該病四季、任何年齡均可發(fā)病，通過(guò)含有病毒的飛沫、霧滴，或經(jīng)污染的用具進(jìn) 行傳播。常于機(jī)體抵抗力降低時(shí)，如受寒、勞累、淋雨等情況，原已存在或由外界侵入的病毒 或細(xì)菌，迅速生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致感染，成人一般5-7天痊愈。
[0003] 兒童感染呼吸道病原體通常誘發(fā)急性呼吸道感染（ARI)，ARI是嬰幼兒、兒童常見(jiàn) 疾病，常繼發(fā)支氣管炎、肺炎、副鼻竇炎，少數(shù)可并發(fā)急性腦膜炎、心肌炎、腎炎、風(fēng)濕熱等， 并發(fā)癥嚴(yán)重危害兒童的身體健康。已證實(shí)95%的ARI由細(xì)菌以外的病原體所致，病毒為ARI 主要病原體。不同年齡兒童對(duì)病毒易感性有所區(qū)別，據(jù)WHO數(shù)據(jù)顯示，呼吸道感染是世界范 圍內(nèi)低齡兒童（〈5歲）死亡的首位原因，每年可造成約500萬(wàn)兒童死亡。兒童急性呼吸道感 染的患病次數(shù)平均為3-8次/年，在1歲兒童中感染的比例約1~3%，學(xué)齡兒童至5%~ 10%。由于各時(shí)期流行的病毒種類(lèi)和型別不盡相同，有時(shí)少數(shù)幾種不同病毒又可混合感染， 因此對(duì)兒童呼吸道病毒病原的監(jiān)測(cè)有著非常重要的意義。早期快速診斷呼吸道病毒感染能 夠及時(shí)指導(dǎo)臨床治療為合理選擇抗病毒抗細(xì)菌藥物提供依據(jù)并在防止抗生素濫用方面具 有重要意義。
[0004] 呼吸道病毒指能夠侵染呼吸道或通過(guò)呼吸道進(jìn)行傳播的病毒，至少涉及到8個(gè) 科，200多種型別的病毒。臨床常見(jiàn)的可導(dǎo)致呼吸道感染的病毒包括正粘病毒科的甲型流感 病毒（InfA)和乙型流感病毒（InfB)，副粘病毒科的副流感病毒1-3型（PIV1-PIV3)、呼吸 道合胞病毒（RSV)、人偏肺病毒（hMPV)，腺病毒科的腺病毒（AdV)、細(xì)小RNA病毒科的鼻病毒 (HRV)、冠狀病毒（Corn)以及腸道病毒（Entv)等。目前檢測(cè)常見(jiàn)呼吸道病毒的方法較多， 但都存在不足，如電鏡檢測(cè)方法復(fù)雜昂貴，病毒分離培養(yǎng)耗時(shí)極長(zhǎng)且假陰性較多，在拿到培 養(yǎng)結(jié)果后通常已失去臨床意義，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)的是病毒特異性抗體但一次僅能檢測(cè)一種 病毒。而基于核酸擴(kuò)增的核酸檢測(cè)，由于速度快（通常3小時(shí)內(nèi)可完成檢測(cè)）、靈敏度高、特 異性好，在病毒檢測(cè)領(lǐng)域正逐漸成為金標(biāo)準(zhǔn)。
[0005] 依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)（Nucleic Acid Sequence Based Amplification)，即 NASBA擴(kuò)增技術(shù)，是由一對(duì)引物介導(dǎo)的、在體外特異性并連續(xù)均一的對(duì)單鏈RNA進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò) 增的過(guò)程。在41°C恒溫條件下，在反應(yīng)速度方面，NASBA擴(kuò)增Ih可將模板RNA擴(kuò)增約IO 9~ 1〇12倍，而通常的PCR反應(yīng)需要2~3h。在檢測(cè)靈敏度方面，NASBA可以檢測(cè)到溶液中低 于IOgene copies/μ 1的痕量革El標(biāo)，而PCR的檢測(cè)限在100gene copies/μ 1左右。因此， NASBA技術(shù)無(wú)論是擴(kuò)增效率還是檢測(cè)靈敏度都高于RT-PCR技術(shù)。而又由于NASBA的反應(yīng)僅 需要一個(gè)41°C的恒溫條件，水浴鍋即可滿(mǎn)足反應(yīng)要求，不需要復(fù)雜的升降溫等常規(guī)PCR所 依賴(lài)的溫控設(shè)備，因此NASBA技術(shù)的儀器成本非常低廉。與相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)結(jié)合，NASBA還 具有操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)呼吸道病毒的引物對(duì)組。
[0007] 本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)呼吸道病毒的引物對(duì)組，由如下16個(gè)引物對(duì)組成：
[0008] 由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)1 ;由序列表 中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)2 ;由序列表中序列5和序列6 所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)3 ;由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA 分子組成的引物對(duì)4 ;由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì) 5 ;由序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)6 ;由序列表中序 列13和序列14所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)7 ;由序列表中序列15和序列16所 示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)8 ;由序列表中序列17和序列18所示的兩條單鏈DNA 分子組成的引物對(duì)9 ;由序列表中序列19和序列20所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物 對(duì)10 ;由序列表中序列21和序列22所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)11 ;由序列表 中序列23和序列24所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)12 ;由序列表中序列25和序列 26所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)13 ;由序列表中序列27和序列28所示的兩條單 鏈DNA分子組成的引物對(duì)14 ;由序列表中序列29和序列30所示的兩條單鏈DNA分子組成 的引物對(duì)15 ;由序列表中序列31和序列32所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)16。
[0009] 其中，所述引物對(duì)I(InfAJT)用于擴(kuò)增甲型流感病毒；所述引物對(duì)2 (InfAJll)用 于擴(kuò)增甲型流感病毒Hl亞型；所述引物對(duì)3(InfA_H3)用于擴(kuò)增甲型流感病毒H3亞型；所 述引物對(duì)4(InfB_TY)用于擴(kuò)增乙型流感病毒；所述引物對(duì)5(RSV_TY)用于擴(kuò)增呼吸道合胞 病毒；所述引物對(duì)6(HRV_TY)用于擴(kuò)增鼻病毒；所述引物對(duì)7(ADV_TY)用于擴(kuò)增腺病毒；所 述引物對(duì)8 (PIVl)用于擴(kuò)增副流感病毒I型；所述引物對(duì)9 (PIV2)用于擴(kuò)增副流感病毒II 型；所述引物對(duì)10 (PIV3)用于擴(kuò)增副流感病毒III型；所述引物對(duì)11 (Corn_0C)用于擴(kuò)增 冠狀病毒HKU1/0C43 ;所述引物對(duì)12(Corn_NL)用于擴(kuò)增冠狀病毒229E/NL63 ;所述引物對(duì) 13(hMPV_TY)用于擴(kuò)增人偏肺病毒；所述引物對(duì)14(Entv_TY)用于擴(kuò)增腸道病毒；所述引物 對(duì)15(EV71_VP1)用于擴(kuò)增腸道病毒EV71型；所述引物對(duì)16(CA16_VP1)用于擴(kuò)增腸道病毒 CA16 型。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)呼吸道病毒的成套單鏈DNA。
[0011] 本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)呼吸道病毒的成套單鏈DNA，由探針組和所述引物對(duì)組 組成；所述探針組由如下16個(gè)單鏈DNA探針組成：序列表中序列33所示的單鏈DNA探針1 ; 序列表中序列34所示的單鏈DNA探針2 ;序列表中序列35所示的單鏈DNA探針3 ;序列表 中序列36所示的單鏈DNA探針4 ;序列表中序列37所示的單鏈DNA探針5 ;序列表中序列 38所示的單鏈DNA探針6 ;序列表中序列39所示的單鏈DNA探針7 ;序列表中序列40所示 的單鏈DNA探針8 ;序列表中序列41所示的單鏈DNA探針9 ;序列表中序列42所示的單鏈 DNA探針10 ;序列表中序列43所不的單鏈DNA探針11 ;序列表中序列44所不的單鏈DNA 探針12 ;序列表中序列45所示的單鏈DNA探針13 ;序列表中序列46所示的單鏈DNA探針 14 ;序列表中序列47所示的單鏈DNA探針15 ;序列表中序列48所示的單鏈DNA探針16。
[0012] 其中，所述單鏈DNA探針I(yè) (InfA_TY_MB)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述引物對(duì)1的擴(kuò)增結(jié)果； 所述單鏈DNA探針2 (InfA_Hl_MB)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述引物對(duì)2的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探 針3 (InfA_H3_MB)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述引物對(duì)3的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針4 (InfB_TY_ MB)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述引物對(duì)4的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針5 (RSV_TY_MB)用于實(shí)時(shí)監(jiān) 測(cè)所述引物對(duì)5的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針6 (HRV_TY_MB)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述引物對(duì)6 的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針7 (ADV_TY_MB)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述引物對(duì)7的擴(kuò)增結(jié)果；所 述單鏈DNA探針8 (PIV1_TY_MB)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述引物對(duì)8的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探 針9(PIV2_TY_MB)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述引物對(duì)9的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針10(PIV3_TY_ MB)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述引物對(duì)10的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針11 (Corn_0C_MB)用于實(shí) 時(shí)監(jiān)測(cè)所述引物對(duì)11的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針12 (Corn_NL_MB)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述 弓丨物對(duì)12的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針13 (hMPV_TY_MB)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述引物對(duì)13的 擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針14(Entv_TY_MB)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述引物對(duì)14的擴(kuò)增結(jié)果；所 述單鏈DNA探針15 (EV71_VP1_MB)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述引物對(duì)15的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA 探針16(CA16_VP1_MB)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述引物對(duì)16的擴(kuò)增結(jié)果。
[0013] 所述探針組中的每條單鏈DNA探針的5'端均標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'端均標(biāo) 記有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
[0014] 在本發(fā)明所提供的所述成套單鏈DNA中，每個(gè)引物對(duì)及其對(duì)應(yīng)的單鏈DNA探針可 單獨(dú)包裝在一個(gè)包裝內(nèi)。如所述引物對(duì)1和所述單鏈DNA探針1包裝在第一個(gè)包裝內(nèi)；所 述引物對(duì)2和所述單鏈DNA探針2包裝在第二個(gè)包裝內(nèi)；所述引物對(duì)3和所述單鏈DNA探 針3包裝在第三個(gè)包裝內(nèi)；所述引物對(duì)4和所述單鏈DNA探針4包裝在第四個(gè)包裝內(nèi)；所述 引物對(duì)5和所述單鏈DNA探針5包裝在第五個(gè)包裝內(nèi)；所述引物對(duì)6和所述單鏈DNA探針 6包裝在第六個(gè)包裝內(nèi)；所述引物對(duì)7和所述單鏈DNA探針7包裝在第七個(gè)包裝內(nèi)；所述引 物對(duì)8和所述單鏈DNA探針8包裝在第八個(gè)包裝內(nèi)；所述引物對(duì)9和所述單鏈DNA探針9 包裝在第九個(gè)包裝內(nèi)；所述引物對(duì)10和所述單鏈DNA探針10包裝在第十個(gè)包裝內(nèi)；所述引 物對(duì)11和所述單鏈DNA探針1包裝在第^^一個(gè)包裝內(nèi)；所述引物對(duì)12和所述單鏈DNA探 針12包裝在第十二個(gè)包裝內(nèi)；所述引物對(duì)13和所述單鏈DNA探針13包裝在第十三個(gè)包裝 內(nèi)；所述引物對(duì)14和所述單鏈DNA探針14包裝在第十四個(gè)包裝內(nèi)；所述引物對(duì)15和所述 單鏈DNA探針15包裝在第十五個(gè)包裝內(nèi)；所述引物對(duì)16和所述單鏈DNA探針16包裝在第 十六個(gè)包裝內(nèi)。
[0015] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)呼吸道病毒的試劑盒。
[0016] 本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)呼吸道病毒的試劑盒，含有所述引物對(duì)組或所述成套單 鏈 DNA。
[0017] 所述試劑盒還可含有內(nèi)對(duì)照引物對(duì)和內(nèi)對(duì)照探針。所述內(nèi)對(duì)照引物對(duì)為用于擴(kuò)增 人基因組中管家基因 GAPDH mRNA的引物對(duì)GAPD_IC，由序列表中序列49和序列50所示的 兩條單鏈DNA分子組成。所述內(nèi)對(duì)照探針（GAPD_IC_MB)為序列表中序列51所示的單鏈 DNA探針，用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述內(nèi)對(duì)照引物對(duì)（GAPD_IC)的擴(kuò)增結(jié)果。
[0018] 所述內(nèi)對(duì)照探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) TAMRA0
[0019] 所述試劑盒中還可含有恒溫?cái)U(kuò)增緩沖液和恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液。
[0020] 所述恒溫?cái)U(kuò)增緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：200mM pH 8.0的Tris-HCL， 50mM DTT，IOmM dNTP，IOmM