用于獲得富集的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)物的組合物和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本公開設(shè)及使來自骨髓或密質(zhì)骨的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)物中富集間充質(zhì)干細(xì)胞的 方法。本公開也設(shè)及用于所述富集的培養(yǎng)基。
[000引發(fā)明背景
[0003] 骨髓度M)是一種存在于長骨空腔內(nèi)的柔軟海綿狀組織，且占總體重的約4%。血 細(xì)胞正是在BM內(nèi)從多能造血干細(xì)胞化SC)產(chǎn)生，一種稱為造血作用的過程。間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC)也正是存在于BM內(nèi)并襯于密質(zhì)骨（CB)的壁。MSC負(fù)責(zé)產(chǎn)生機(jī)體的各種細(xì)胞，包括成 纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。除HSC、造血單核細(xì)胞和MSC W外，還有幾類存在于BM和CB內(nèi)的其它類型的細(xì)胞，運(yùn)使得運(yùn)些組織本質(zhì)上高度異質(zhì)。
[0004] 骨髓為造血及間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞W及其它細(xì)胞提供共存和發(fā)揮 功能所必需的特定微環(huán)境或生態(tài)位。干細(xì)胞變得靜止、增殖、分化及響應(yīng)外界信號的決定 就是在運(yùn)些生態(tài)位內(nèi)發(fā)生。最近的一些報告已顯示，不同干細(xì)胞生態(tài)位間發(fā)生交叉對話 (cross-ta化)，W在體內(nèi)引起適當(dāng)反應(yīng)（7、8、9、10)。因此，BM源性細(xì)胞W及襯于CB內(nèi)壁的 細(xì)胞在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中共存并相互影響并不出人意料。BM及CB中存在大量細(xì)胞類型及生 態(tài)位，且它們中發(fā)生的相互聯(lián)系通常轉(zhuǎn)化為含幾種成功和諧共存的細(xì)胞類型的異質(zhì)性體外 培養(yǎng)物。來自BM或娠碎的CB的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)培養(yǎng)物的一個反復(fù)出現(xiàn)的問題是，大 量不需要的污染巨隧細(xì)胞、造血細(xì)胞及可能的其它非間充質(zhì)細(xì)胞群體傾向于相對于培養(yǎng)物 中更罕見的MSC群體過度生長。BM及CB源性MSC的培養(yǎng)物通常過度生長巨隧細(xì)胞，巨隧細(xì) 胞常常存在于生長的MSC集落頂部，從而干擾MSC在培養(yǎng)物中的增殖及行為。運(yùn)種體外異 質(zhì)性通常是MSC研究中不需要的，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)測定被設(shè)計成在沒有其它細(xì)胞干擾的情況下研 究或利用那種特定細(xì)胞類型。
[0005] CSF-1是一種與CSF1R寡聚，從而導(dǎo)致運(yùn)種受體轉(zhuǎn)憐酸化（trans-phospho巧latio n)，W促進(jìn)單核吞隧細(xì)胞譜系的細(xì)胞存活、增殖及分化成巨隧細(xì)胞的細(xì)胞因子（4、6)。與 其調(diào)節(jié)巨隧細(xì)胞譜系的作用一致，外源性CSF-1導(dǎo)致小鼠中單核細(xì)胞及巨隧細(xì)胞產(chǎn)量增加 (11)，而非功能性CSF-U12)或CSF1R(13)小鼠顯示巨隧細(xì)胞數(shù)量不足，運(yùn)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)減 少。
[0006] 造血單核細(xì)胞的一種表型特性是在其細(xì)胞表面膜上表達(dá)CSF1R。在運(yùn)些細(xì)胞上，激 活CSF1R導(dǎo)致增殖及分化。運(yùn)種受體的激活是通過使CSF-1配體結(jié)合至CSF1R而介導(dǎo)。運(yùn) 種寡聚作用引起S憐酸腺巧（ATP)-依賴性酪氨酸激酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，其最終引導(dǎo)造血 單核細(xì)胞增殖和/或分化。
[0007] GW2580[5-(3-甲氧基-4-((4-甲氧基芐基）氧基）芐基）喀晚-2, 4-二胺]及 KI20227 {N- {4-[化7-二甲氧基-4-哇嘟基）氧基]-2-甲氧基苯基} -NO- [1- (1，3-嚷 挫-2-基）乙基]脈}屬于一類通過與ATP競爭結(jié)合至CSF1R激酶而特異性抑制CSF1R激 酶活性的小分子（14)。已顯示，GW2580在60nM下完全抑制人類CSF1R激酶，但保持對26種 其它測試的激酶無活性（3)。此外，在700nM下，GW2580完全抑制小鼠骨髓細(xì)胞的CSF-1-依 賴性生長，而CSF-1-非依賴性細(xì)胞系、人類成纖維細(xì)胞及其它內(nèi)皮細(xì)胞對GW2580保持高度 抗性（3)。
[000引發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明人已表明，在人類及小鼠BM及CB細(xì)胞培養(yǎng)物中用小分子及其它具有類似 性質(zhì)的化合物特異性抑制CSF1R激酶可減少培養(yǎng)物中成熟巨隧細(xì)胞的數(shù)量，其進(jìn)而得到富 集的MSC培養(yǎng)物。此外，運(yùn)些分子或化合物對培養(yǎng)物中存在的其它非間充質(zhì)細(xì)胞或衍生的 祖細(xì)胞也有影響?？傊?，使用此類化合物可富集間充質(zhì)細(xì)胞，同時移除分化的非間充質(zhì)細(xì)胞 或抑制其存在。
[0010] 因此，本公開設(shè)及一種培養(yǎng)間充質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的方法，該方法包括使細(xì)胞與含 CSF1R激酶抑制劑的培養(yǎng)基接觸。
[0011] 本公開也設(shè)及一種培養(yǎng)來自骨髓和/或密質(zhì)骨的細(xì)胞W使細(xì)胞培養(yǎng)物富集間充 質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的方法，其包括使細(xì)胞培養(yǎng)物與含CSF1R激酶抑制劑的培養(yǎng)基接觸。
[0012] 在一實(shí)施方案中，方法包括：
[0013] a)從得自受試者的組織樣本收獲細(xì)胞，其中所收獲的細(xì)胞包含間充質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì) 胞，及
[0014] b)使所收獲的細(xì)胞與含CSF1R激酶抑制劑的培養(yǎng)基接觸。
[0015] 在一實(shí)施方案中，方法還包括C)得到富集間充質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的細(xì)胞群體。
[0016] 任選地，CSF1R激酶抑制劑為GW2580、KI20227、HY-13075、cFMS受體抑制劑II、 cFMS受體抑制劑III、cFMS受體抑制劑IV或ARRY-382。
[0017] 在另一實(shí)施方案中，所收獲的細(xì)胞還包含非間充質(zhì)細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，非間 充質(zhì)細(xì)胞為巨隧細(xì)胞。
[0018] 在另一實(shí)施方案中，方法是在體外進(jìn)行。
[0019] 在另一實(shí)施方案中，間充質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞包含間充質(zhì)干細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞 及基質(zhì)源性細(xì)胞中的至少一種。
[0020] 在另一實(shí)施方案中，組織樣本包括骨髓、密質(zhì)骨、脂肪組織或存在MSC的任何組 織。
[0021] 在另一實(shí)施方案中，使細(xì)胞與培養(yǎng)基接觸至少一小時、至少一天或至少一周。
[0022] 在另一實(shí)施方案中，在使細(xì)胞與培養(yǎng)基接觸之前，間充質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的濃度為 至少10個細(xì)胞/cm2。
[0023] 在另一實(shí)施方案中，間充質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞保留其形成脂肪形成、軟骨形成及成骨 細(xì)胞譜系的能力。
[0024] 在一實(shí)施方案中，來自骨髓和/或密質(zhì)骨的細(xì)胞包含間充質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞及非間 充質(zhì)細(xì)胞。
[00巧]本公開還設(shè)及一種可用于培養(yǎng)間充質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞和/或富集間充質(zhì)細(xì)胞譜系 細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0026] 在一實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含CSF1R激酶抑制劑。
[0027] 在另一實(shí)施方案中，CSF1R激酶抑制劑是一種通過與ATP競爭結(jié)合至CSFR1激酶 而抑制CSF1R激酶活性的小分子。
[0028] 在另一實(shí)施方案中，CSF1R激酶抑制劑為GW2580、KI20227、HY-13075、cFMS受體 抑制劑II、cFMS受體抑制劑III、cFMS受體抑制劑IV或ARRY-382。任選地，培養(yǎng)基包含 1-lOyMGW2580。
[0029] 在另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)基還包含至少一種生長因子。任選地，至少一種生長因子 選自由FGF、EGF及IGF組成的列表。
[0030] 在另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基。任選地，基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自達(dá)爾伯克氏 改良伊格爾培養(yǎng)基值MEM)、高級DMEM、BiogroTM、SkGMTM、Ham'SF10、Ham'SF12、伊思考 夫改良達(dá)爾伯克氏培養(yǎng)基（Iscove'smodifiedDu化ecco'smedium)、neu;robasal培養(yǎng)基、 RPMI1640 及MCDB120 培養(yǎng)基。
[0031] 在另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)基還包含補(bǔ)充劑。任選地，補(bǔ)充劑選自：
[0032] ?膜島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白及亞砸酸鹽（IT巧；
[0033] ?B27 ；
[0034]?地塞米松（dexamethasone)、膜島素、EGF、胎球蛋白及白蛋白；及 [00巧]?地塞米松、bFGF、白蛋白及膜島素。
[0036] 在另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)基還包含脂質(zhì)。任選地，脂質(zhì)是花生四締酸、膽固醇、 Dka-生育酪乙酸醋、亞油酸、亞麻酸、肉豆違酸、油酸、棟桐油酸、棟桐酸及硬脂酸中的至 少一種。
[0037] 附圖簡述
[003引現(xiàn)在將參照附圖詳細(xì)地描述本公開，其中：
[0039] 圖1顯示，用liiMGW2580處理的BM源性細(xì)胞的集落形成單位-成纖維細(xì)胞 (C即-巧培養(yǎng)物的巨隧細(xì)胞污染減少，且MSC集落的數(shù)量及尺寸較大。A，W所示密度將細(xì)胞 接種于6孔板中，并用媒介物（對照）或liiMGW2580處理14天。固定培養(yǎng)物并用甲苯胺 藍(lán)染色，并評估MSCC即-F。對照培養(yǎng)物顯示更小的MSCC即-F，運(yùn)些培養(yǎng)物過度生長深色 高度致密的巨隧細(xì)胞。用1yMGW2580處理的培養(yǎng)物顯示較大的富集的MSCC即-F，其基本 上不含巨隧細(xì)胞。B，計算對照培養(yǎng)物及經(jīng)GW2580處理的培養(yǎng)物中的集落數(shù)量。當(dāng)與對照 培養(yǎng)物相比時，經(jīng)GW2580處理的培養(yǎng)物的集落數(shù)量增加至少20%。
[0040] 圖2顯示，用1yMGW2580處理的CB源性細(xì)胞的CFU-F培養(yǎng)物的巨隧細(xì)胞污染減 少，且MSC集落的數(shù)量及尺寸較大。A，W所示密度將細(xì)胞接種于6孔板中，并用媒介物（對 照）或lyMGW2580處理14天。固定培養(yǎng)物并用甲苯胺藍(lán)染色，并評估MSCC即-F。對 照培養(yǎng)物顯示更小的MSCCFU-F，運(yùn)些培養(yǎng)物過度生長深色高度致密的巨隧細(xì)胞。用liiM GW2580處理的培養(yǎng)物顯示較大的富集的MSCC即-F，其基本上不含巨隧細(xì)胞。B，計算對照 培養(yǎng)物及經(jīng)GW2580處理的培養(yǎng)物中的集落數(shù)量。當(dāng)與對照培養(yǎng)物相比時，經(jīng)GW2580處理 的培養(yǎng)物的集落數(shù)量增加至少24%。
[0041] 圖3顯示，源自BM或CB并用1yMGW2580處理的MSC培養(yǎng)物的巨隧細(xì)胞污染減 少，且富集MSC。BM及CB的處于第2代（P2)的對照未處理培養(yǎng)物過度生長巨隧細(xì)胞（小 的高折射性細(xì)胞），而用1yMGW2580處理的MSC培養(yǎng)物是富集的，且基本上無巨隧細(xì)胞污 染。
[004引 圖4顯示，將BM及CB-源性MSC培養(yǎng)物暴露于1yMGW2580導(dǎo)致巨隧細(xì)胞在P1 時分別減少20%及50%。對暴露于1^16胖2580的81的？1培養(yǎng)物進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析， 結(jié)果表明全部活細(xì)胞中有62%是由CD457CDUb+成熟巨隧細(xì)胞組成。在BM對照培養(yǎng)物中， 運(yùn)個群體占全部活細(xì)胞的82 %，因此代表經(jīng)GW2580處理的培養(yǎng)物中的巨隧細(xì)胞減少20 %。 同樣地，用1yMGW2580處理CB培養(yǎng)物，結(jié)果表明運(yùn)些培養(yǎng)物包含34%CD457CDUb+成熟 巨隧細(xì)胞，代表與含有84%巨隧細(xì)胞的對照培養(yǎng)物相比減少50%。
[0043] 圖5顯示，在整個傳代過程中（P0-P3)用1yMGW2580連續(xù)處理BM培養(yǎng)物可大大 減少巨隧細(xì)胞數(shù)量，同時維持富集的MSC群體。對照培養(yǎng)物顯示大量小的具有折射性的污 染巨隧細(xì)胞，而用1yMGW2580處理的培養(yǎng)物含有的運(yùn)些污染巨隧細(xì)胞的數(shù)量大幅減少。此 夕F，經(jīng)GW2580處理的培養(yǎng)物呈現(xiàn)具有MSC特征的成纖維樣細(xì)胞的數(shù)量較多。
[0044] 圖6顯示，從P0到P2將BM源性培養(yǎng)物暴露于1yMGW2580導(dǎo)致CD45+細(xì)胞總體 減少18%，且分化為CD457CDUb7Scal成熟巨隧細(xì)胞的CD45 7CDUb7Scar單核細(xì)胞減 少36%，運(yùn)是由流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)。對培養(yǎng)物中的CD45+細(xì)胞進(jìn)行口控（gated),并在運(yùn) 個群體中分析CDUb及Seal的表達(dá)。在對照培養(yǎng)物中，92%的CD45+細(xì)胞也是CD1化+(成 熟巨隧細(xì)胞），且8 %的細(xì)胞是CDUb7Scar。在經(jīng)GW2580處理的培養(yǎng)物中，56 %的CD45+ 細(xì)胞是CDUb7Scal，且44%的細(xì)胞是CDUb7Scar，由此表明，與對照培養(yǎng)物相比時，36% 的造血單核細(xì)胞未分化成巨隧細(xì)胞。
[0045] 圖7顯示，從P0到P3將BM源性培養(yǎng)物暴露于1yMGW2580導(dǎo)致CD45+細(xì)胞總體 減少64%，且分化為CD457CDUb7Scal巨隧細(xì)胞的CD45 7CDUb7Scar造血單核細(xì)胞減 少52%，運(yùn)是由流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)。對培養(yǎng)物中的CD45+細(xì)胞進(jìn)行口控，并在運(yùn)個群體中 分析CD1化及Seal的表達(dá)。在對照培養(yǎng)物中，99 %的CD45+細(xì)胞也是CDUb+ (分化的巨隧 細(xì)胞），且<1%的細(xì)胞是CDllb7Scar造血單核細(xì)胞。在經(jīng)GW2580處理的培養(yǎng)物中，41% 的CD45+細(xì)胞是CD1化7Scal，且52%的細(xì)胞是CDUb7Scar，由此表明，與對照培養(yǎng)物相比 時，52%的單核細(xì)胞祖細(xì)胞未分化成巨隧細(xì)胞。
[0046] 圖8顯示，在整個傳代過程中（P0-P3)用1yMGW2580連續(xù)處理CB培養(yǎng)物可大大 減少巨隧細(xì)胞數(shù)量，同時維持富集的MSC群體。對照培養(yǎng)物顯示大量小的具有折射性的污 染巨隧細(xì)胞，而用1yMGW2580處理的培養(yǎng)物含有的運(yùn)些污染巨隧細(xì)胞的數(shù)量大幅減少。此 夕F，經(jīng)GW2580處理的培養(yǎng)物呈現(xiàn)具有MSC特征的成纖維樣細(xì)胞的數(shù)量較多。
[0047] 圖9顯示，從P0到P2將CB源性培養(yǎng)物暴露于1yMGW2580導(dǎo)致CD45+細(xì)胞總體 減少15%，且分化為CD457CDUb7Scal成熟巨隧細(xì)胞的CD45 7CDUb7Scar造血單核細(xì) 胞減少22%，運(yùn)是由流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)。對培養(yǎng)物中的CD45+細(xì)胞進(jìn)行口控，并在運(yùn)個群 體中分析CDUb及S