Smith,C.K.，Hewage，C. M. ,Fry,S.C.feSadler,I.H.a-d-Mannopyranosyl-(1-〉4)-a-d-glucuronopyranosyl-(1-〉2)-myo-inositol,anewandunusualoligosaccharidefromculturedrose cells.Phytochemistry52, 387-396 (1999)，其產(chǎn)生可比較的二聚體，a-D-葡萄糖醒酸 基-a-2)-肌醇，加甘露糖）。其他標志物是商業(yè)葡萄糖和半乳糖醒酸。用硝酸銀染色 后(Fry,S.C.TheGrowingPlantCellWall:ChemicalandMetabolicAnalysis.The BlacldmrnPress,Caldwell,化wJersey(2000)，掃描電泳圖并將相關(guān)斑點在化otoShop 中針對灰色密度量化，如Parsons等人的補充圖1中所述（Alternativepathwaysof dehydro曰scorbic曰ciddegr曰d曰tioninvitro曰ndinpi曰ntcellcultures:novel insightsintovitaminCcatabolismBiochem.J. 440, 375-383(2011)。
[0149] 免疫和攻擊。
[0150] 對9周齡1。1雌性小鼠化曰4曰11〇1曰(3,8^6316'，1]1()給予每只小鼠^次劑量的 67y1PBS和33y1Imject明抓佐劑（Pierce,Rockford，比，USA)中的包含2yg植物來源 的肺炎球菌多糖的植物提取物（如通過Ouchterlony方法估計的）。小鼠在第0、10、20和 30天腹膜內(nèi)免疫。假免疫的小鼠使用相同時間表接受包含不相關(guān)免疫原化LH)的明抓佐 劑。血清樣品通過在每次免疫之前的尾部取血獲得。小鼠在第260天時用2. 8x106c化血 清型3肺炎雙球菌腹膜內(nèi)攻擊。動物的健康狀況根據(jù)Modon等人的方案來監(jiān)測（(1985)m VetRecord, 116:431-436)。運些實驗在來自UKHomeOffice的項目許可下完成。
[0151] ELISA.
[0152] MaxisorbELISA孔（Gibco6化,Nuncproducts)在 22°C下用包被緩沖液巧OnM NaHC03抑9. 6, 0. 02% (w/v)NaN3)中2yg/ml純化的3型肺炎球菌多糖（ATCC)包被16h。 用PBS沖洗后，孔用PBSW% (w/v)Marvel在37°C下封閉比并用洗涂緩沖液巧OmMTris肥1 pH7. 5，150mM化C1、0. 05% (v/v)吐溫20)洗涂；次。小鼠血清W封閉緩沖液1:100稀 釋，并將100y1加入至孔并在37°C下振蕩溫育2小時。將板如前洗涂立次，并使用堿性憐 酸酶綴合的山羊抗小鼠IgG二抗（Fc特異性，Sigma;1:5000稀釋的）和在1M二乙醇胺抑 9. 8,0. 5MMgC12中溶解的Img/ml憐酸對硝基苯醋（Sigma)檢測結(jié)合的抗體。在37°C下1 小時后于405皿處讀取吸光度，且IgG濃度通過參考用鼠IgG(StatensSerumInstitute) 制備的標準曲線來確定。
[0153] 詳細討論
[0154] cps3S基因從肺炎球菌菌株WU2的DNA中擴增，并克隆進農(nóng)桿菌雙元載體pCambia 2301 (GAMBIA,Canberra,Australia)，得到pCMS4。運種克隆將cps3S放置在重復(fù)的組成型 花挪菜花葉病毒啟動子CaMV35S的控制下。它還提供了來自煙草發(fā)病機理相關(guān)的蛋白PR化 的信號序列，W將轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)引導至質(zhì)外體。該載體還使隨后選擇轉(zhuǎn)化的植物 能夠用卡那霉素進行。pCMS4中cps3S的測序表明它與先前公布的序列（Arrecubieta，等 人Gene167, 1-7(1996))相同。
[01巧]質(zhì)粒PCMS4通過根癌農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移成功地克隆進煙草。T1代由六個植株 的種子生長，并且使用PCRW顯示運些植株中的四個包含cps3S基因，但不包含根癌農(nóng)桿菌 DNA(參見圖1)。用cps3S特異性引物的RT-PCR顯示了轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達（圖3A 示出了來自一個轉(zhuǎn)基因植株的數(shù)據(jù)）。由RNA提取物的直接PCR擴增沒有生成PCR產(chǎn)物，證 實不存在任何污染性cps3SDNA(圖3A)。還通過PCR確認了不存在污染性農(nóng)桿菌DNA(參 見圖3B)。所有四個植株通過Ouchterlony免疫測定葉片組織的提取物顯示合成3型多糖 (參見圖3B，示出了來自=個植株的結(jié)果）。第二代的生長證實了轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定表達（數(shù)據(jù) 未示出）。盡管沒有嘗試最大化cps3S的表達和多糖的合成，基于Ouchterlony數(shù)據(jù)，評價 3型多糖的產(chǎn)量為約4yg/g葉片。
[0156] 為了測試植物來源的肺炎球菌3型多糖的免疫原性，將小鼠用=次劑量的來自轉(zhuǎn) 基因或野生型煙草植物的粗質(zhì)外體提取物經(jīng)腹膜內(nèi)免疫。在每次免疫的前一天和最后劑量 后十天收集血清，且抗3型多糖的IgG通過化ISA確定。與野生型葉片提取物相比，單次劑 量的來自轉(zhuǎn)基因葉片的提取物之后，檢測到顯著更多（P<〇. 05)的抗3型多糖IgG(圖4A)。 在第二次劑量的轉(zhuǎn)基因葉片提取物之后，抗3型抗體的濃度存在進一步增加（P<0. 05)。在 最終免疫劑量后二百S十天，將小鼠W血清型3肺炎鏈球菌菌株皿565經(jīng)鼻內(nèi)攻擊。觀察 小鼠發(fā)展疾病的跡象長達十天。用轉(zhuǎn)基因植物提取物免疫的小鼠比給予野生型植物提取 物的小鼠存活顯著更長（P<〇. 001)(對于轉(zhuǎn)基因和野生型的平均存活分別為18比±72和 9化±23)。用野生型植物提取物感染的小鼠并沒有比假免疫的小鼠存活更久（平均存活 9比±38) (P〉0.05)。在攻擊后10天，用野生型植物提取物免疫的十五只動物都沒有存活， 而用轉(zhuǎn)基因植物提取物免疫的十四只中的八只存活至研究的結(jié)束（圖4B)。
[0157] 總之，本文示出的數(shù)據(jù)證明了W下原理：細菌多糖可在植物中合成并可使用運些 植物的簡單提取物作為免疫原W保護免受否則是致命的感染。
[015 引
[0159]
[0160]
[0161]
[0162]
[0163]
【主權(quán)項】
1. 一種在宿主植物細胞中產(chǎn)生細菌莢膜糖、細菌膜糖和/或細菌或病毒免疫原性糖的 方法，所述方法包括： 1) 提供植物細胞； 2) 向所述植物細胞中引入異源蛋白或核苷酸序列，所述異源蛋白或核苷酸序列使所述 細菌或病毒的糖能夠在所述植物細胞中產(chǎn)生； 3) 在用于糖生物合成的合適條件下維持所述宿主植物細胞；以及任選地 4) 從所述宿主植物細胞收獲所述細菌或病毒的糖。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的在植物細胞中產(chǎn)生細菌莢膜糖、細菌膜糖和/或細菌或病毒 免疫原性糖的方法，所述方法還包括以下步驟： (i) 確定所述細菌或病毒的糖的分子結(jié)構(gòu)和/或闡明天然細菌或病毒的糖生物合成途 徑； (ii) 將i)中確定的所述細菌或病毒的糖的分子結(jié)構(gòu)和/或所述天然細菌或病毒的糖 生物合成途徑與所述宿主植物細胞的天然植物糖的分子結(jié)構(gòu)和/或天然植物糖生物合成 途徑比較，以確定所述天然植物糖生物合成途徑中使其能夠用于產(chǎn)生細菌或病毒的糖所需 要的任何反應(yīng)步驟； (iii) 確定可提供ii)中確定的使細菌或病毒的糖能夠在所述宿主植物細胞中產(chǎn)生的 反應(yīng)步驟的蛋白或核苷酸序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述異源核苷酸序列編碼細菌或病 毒的酶、或其功能片段或衍生物。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3的任一項所述的方法，其中所述方法還包括在所述植物細胞中 提供抑制或下調(diào)天然植物糖生物合成途徑或反應(yīng)步驟的蛋白或核苷酸序列，以使所述細菌 或病毒的糖能夠在所述宿主植物細胞中產(chǎn)生。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一項所述的方法，其中所述方法還包括在所述宿主植物細 胞中提供蛋白或核苷酸序列以使能夠產(chǎn)生用于糖生物合成的底物，其中所述底物對于所述 宿主植物細胞是異源的。6. 根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項所述的方法，其中所述糖是細菌起源的、優(yōu)選地鏈球菌 (streptococcal)起源的、更優(yōu)選地肺炎球菌（pneumococcal)起源的。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中糖是細菌莢膜多糖、優(yōu)選地3型莢膜多糖。8. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述異源糖生物合成基因是肺炎球菌多糖 合成基因。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述異源糖生物合成基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶或糖基 合酶、或表1中列出的酶、或cap3A、B、或C基因產(chǎn)物（例如Cps3S)。10. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中兩種或更多種異源糖生物合成基因在所 述植物細胞中表達。11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10所述的方法，所述方法另外包括從所述宿主植物細胞提取所 述糖。12. -種修飾的植物細胞，所述修飾的植物細胞能夠產(chǎn)生細菌莢膜糖、細菌膜糖和/或 細菌或病毒免疫原性糖，其中所述植物細胞包含使所述細菌或病毒的糖能夠在所述宿主植 物細胞中產(chǎn)生的異源蛋白和/或核苷酸序列。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的修飾的植物細胞，其中所述植物細胞包含抑制或下調(diào)天然 植物糖生物合成途徑反應(yīng)步驟的蛋白或核苷酸序列，以使所述細菌或病毒的糖能夠在所述 宿主植物細胞中產(chǎn)生。14. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的修飾的植物細胞，其中所述植物細胞包含蛋白或核苷 酸序列以使能夠產(chǎn)生用于糖生物合成的底物，其中所述底物對于所述宿主植物細胞是異源 的。15. 根據(jù)權(quán)利要求12至14的任一項所述的植物細胞，其中所述異源糖生物合成蛋白或 核苷酸序列或酶是植物、細菌、古細菌、真菌、無脊椎動物或脊椎動物起源的。16. 根據(jù)權(quán)利要求12至15的任一項所述的植物細胞，其中所述異源糖生物合成蛋白或 核苷酸序列是細菌的、病毒的、或源自病毒感染的細胞。17. 根據(jù)權(quán)利要求12至16的任一項所述的植物細胞，其中所述異源糖生物合成基因是 肺炎球菌多糖合成基因。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的植物細胞，其中所述異源糖生物合成基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶 或糖基合酶、或表1中列出的酶、或cap3A、B、或C基因產(chǎn)物（例如Cps3S)。19. 根據(jù)權(quán)利要求12至18的任一項所述的植物細胞，其中所述糖是細菌起源的、優(yōu)選 地鏈球菌起源的、更優(yōu)選地肺炎球菌起源的。20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的植物細胞，其中糖是細菌莢膜多糖、優(yōu)選地3型莢膜多糖。21. -種植物、植物組織或植物提取物，所述植物、植物組織或植物提取物包含根據(jù)權(quán) 利要求12至20的任一項所述的植物細胞和/或由根據(jù)權(quán)利要求1至11的任一項所述的 方法產(chǎn)生的細菌或病毒的糖。22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的植物、植物組織或植物提取物作為疫苗、優(yōu)選地作為可食 用疫苗的用途。23. -種干燥的植物、植物組織、或植物提取物愈傷組織，所述干燥的植物、植物組織、 或植物提取物愈傷組織包含根據(jù)權(quán)利要求12至20的任一項所述的植物細胞。24. -種細菌莢膜糖、細菌膜糖和/或細菌或病毒免疫原性糖，所述細菌莢膜糖、細菌 膜糖和/或細菌或病毒免疫原性糖通過根據(jù)權(quán)利要求1至11的任一項所述的方法是可獲 得的。25. -種疫苗，所述疫苗包含通過根據(jù)權(quán)利要求1至11的任一項所述的方法是可獲得 的細菌莢膜糖、細菌膜糖和/或細菌或病毒免疫原性糖。26. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求的植物細胞、植物、植物、植物提取物、或植物組織、或糖在 一種或更多種糖衍生的產(chǎn)品中的用途，所述糖衍生的產(chǎn)品選自由以下組成的組：藥物、醫(yī)療 設(shè)備（包括植入物或手術(shù)填料或手術(shù)線）、疫苗、織物、潤滑劑、化妝品、清潔劑、可注射劑、 原料、健康補充劑、或食品添加劑（諸如凝膠或增稠劑）。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于在植物細胞中產(chǎn)生細菌或病毒的糖，諸如莢膜、免疫原性或膜糖的新方法。還提供了包含這樣的細菌或病毒的糖的植物、植物細胞、植物部分和植物產(chǎn)物。本發(fā)明是基于細菌酶可用于在植物細胞中產(chǎn)生細菌或病毒莢膜、免疫原性和/或膜糖的新發(fā)現(xiàn)。
【IPC分類】C12N15/82, A01H5/00, C07K14/31
【公開號】CN105026566
【申請?zhí)枴緾N201380072651
【發(fā)明人】伊恩·羅伯茨, 彼得·安德魯, 加里·懷特拉姆
【申請人】曼徹斯特大學
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2013年12月10日
【公告號】CA2894578A1, EP2929033A1, US20150313986, WO2014091220A1