Sirt5調(diào)節(jié)劑及其篩選方法
【專利說明】Sirt5調(diào)節(jié)劑及其篩選方法
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01180043047.0、申請(qǐng)日為2011年7月7日、發(fā)明名稱為 "Sirt5調(diào)節(jié)劑及其篩選方法"的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)為國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮?PCT/US2011/043130的國(guó)家階段申請(qǐng)，該國(guó)際申請(qǐng)要求申請(qǐng)日為2010年7月7日、申請(qǐng)?zhí)枮?61/362, 078的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。
[0002] 奪叉引用美國(guó)相關(guān)專利申請(qǐng)
[0003] 本發(fā)明要求美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)（【申請(qǐng)?zhí)枴縉0. 61/362,078,申請(qǐng)日：2010 年7月7日），在此將其作為參考文獻(xiàn)整體引用并到本發(fā)明中。
[0004] 關(guān)于美國(guó)聯(lián)邦咨助研究的說明
[0005] 本發(fā)明得到美國(guó)政府的資助，獲得NIH基金，合同號(hào)為GM086703。因此政府擁有本 發(fā)明的某些權(quán)利。
[0006] 發(fā)曰月背景
[0007] 沉默信息調(diào)控蛋白2(Sir2)或者叫去乙?；福⊿irtuins)，是一個(gè)具有輔酶 (nicotinamideadeninedinucleotide，NAD)依賴蛋白去乙?；钚缘倪M(jìn)化保守的酶家 族(A.A.Sauve,etal. ,Annu.Rev.Biochem. 75:435 (2006) ；S. -i.Imai,etal. ,Trends inPharmacologicalSciences31:212 (2010) ；M.C.Haigis,etal. ,AnnualReview ofPathology:MechanismsofDisease5:253(2010)).自從最初發(fā)現(xiàn)sirtuin的去乙 ?；钚裕⊿.-i.Imai，etal.，Nature403:795(2000) ;K.G.Tanner,etal.，ProcNatl. Acad.Sci.U.S.A. 97:14178(2000))，揭示了sirtuins的很多重要的生物功能，并且也很 好的理解了NAD依賴的去乙酰機(jī)制（S. _i.Imai，etal.，TrendsinPharmacological Sciences31:212 (2010) ；M.C.Haigis,etal. ,AnnualReviewofPathology:Mechanisms ofDisease5:253 (2010))?；谛蛄械南嗨菩?，sirtuins被分為不同的類型 (R.A.Frye,Biochem,Biophys.Res.Commun. 273:793 (2000))。哺乳動(dòng)物有 7 種sirtuins， Sirtsl-7。Sirtsl-3屬于第一類，Sirt4屬于第二類，Sirt5屬于第三類，Sirt6和Sirt7屬 于第四類（R.A.Frye,Biochem.Biophys.Res.Commun. 273:793 (2000))。
[0008] 研究sirtuin活性的一個(gè)主要障礙在于7種人類sirtuins中的4種（Sirt4_7) 要么有非常弱的去乙?；钚裕礇]有去乙?；钚裕‥.Michishita，etal.，Mol.Biol.Cell 16:4623(2005) ；M.C.Haigisetal.,Cell126:941(2006) ；A.Schuetzetal. ,Structure 15:377 (2007) ；G.Liszt,etal. ,J.Biol.Chem. 280 : 21323 (2005) ；E.Michishitaet al. ,Nature452:492(2008))。這對(duì)研究Sirtuins和開發(fā)調(diào)節(jié)他們活性的小分子帶來了許 多困難。比如，由于沒有強(qiáng)活性檢測(cè)方法，所以難以開發(fā)以Sirts4-7為靶點(diǎn)的抑制劑或激 活劑。也難以確認(rèn)以Sirtl、Sirt2和Sirt3為靶點(diǎn)的抑制劑或激活劑是否也同樣作用于 Sirts4_7〇
[0009] 發(fā)明概沐
[0010] Sirt5, 一種線粒體去乙酰化酶，被發(fā)現(xiàn)是一種有效的脫丙二酰和脫琥珀酰酶。這 個(gè)發(fā)現(xiàn)證明了哺乳動(dòng)物線粒體蛋白新的翻譯后進(jìn)行修飾的過程，即賴氨酸殘基的丙二酰化 和琥珀?；irt5去除線粒體蛋白賴氨酸殘基上的戊二酰，丙二酰和琥珀酰基團(tuán)，這個(gè)過 程被認(rèn)為可以可逆的調(diào)節(jié)線粒體蛋白的活性。由于發(fā)現(xiàn)了這個(gè)強(qiáng)酶活性，使得能夠開發(fā)識(shí) 別Sirt5調(diào)節(jié)劑的方法。Sirt5特異性的調(diào)節(jié)劑可被用于研究Sirt5的生物功能和革巴向 Sirt5活性用于治療人類疾病。
[0011] 附圖簡(jiǎn)沐
[0012] 圖1 :使用AMC-琥珀酰肽來測(cè)試Sirt5的熒光實(shí)驗(yàn)。
[0013] 圖2A-2D:Sirt5的結(jié)構(gòu)揭示了一個(gè)不尋常的酰基袋。（A)Sirt5的?；籆HES 的緩沖分子與Argl05和Tyrl02相互作用產(chǎn)生的硫酸鹽部分占據(jù)。所述硫酸酯距離硫代乙 酰基團(tuán)4.2A。.⑶Sirt5-硫代乙酰肽結(jié)構(gòu)和Sir2Tm-乙酰肽結(jié)構(gòu)的對(duì)比。（C)理論預(yù)測(cè)丙二 酰/琥珀酰肽可能是Sirt5更好的底物。（D)Sirt5-琥珀酰肽-NAD三重結(jié)構(gòu)表明琥珀?；?團(tuán)和Tyrl02和Argl05的相互作用。
[0014] 圖3A-3F:Sirt5催化的丙二酰和琥珀酰賴氨酸的水解。純化的去乙酰化酶（Sirtl 0. 75yM或Sirt5 3. 3yM)和0. 3mM的?；囊黄鸱跤?，1.OmMNAD加到含有ImMDIT的 60yL的 20mMTris-HCl緩沖液中（pH7. 5)，在 37°C反應(yīng) 2 小時(shí)。反應(yīng)用 60yL10%TFA 終止。去除沉淀的蛋白后，使用LCMS分析反應(yīng)混合物?；疑€表明?；牡馁|(zhì)量（乙 酰肽，m/z1274. 0 ;丙二酰肽，m/z1318. 0 ;琥珀酰肽，m/zl332. 0)和脫乙酰肽的質(zhì)量（m/z 1232. 0)的離子峰強(qiáng)度（10x放大）。黑色曲線表明所有從100-2000的質(zhì)量（總離子數(shù)或 者TIC)的離子峰強(qiáng)度。對(duì)于Sirtl，當(dāng)H3K9乙酰肽（A)作為底物時(shí)可檢測(cè)出脫乙酰產(chǎn)物， 當(dāng)使用H3K9丙二酰（B)和琥珀酰（C)肽時(shí)沒有水解產(chǎn)物被檢出。對(duì)于Sirt5,脫乙酰產(chǎn)物 很少被檢出（D)，而脫丙二酰（E)和脫琥珀酰（F)產(chǎn)物可以被檢出。
[0015] 圖4A-4B:(A)琥珀酰賴氨酸殘基存在于牛肝臟線粒體中。使用32P-NAD可以 檢出Sirt5催化的丙二酰和琥珀酰肽的水解，形成32P標(biāo)記的0-Ma-ADPR(條帶2)和 0-Su-ADPR(條帶3)。用乙酰肽則沒有反應(yīng)發(fā)生（條帶1)。當(dāng)組蛋白被用作乙酰賴氨酸 (條帶8)或H3K9乙酰肽（條帶4)的來源時(shí)，Sirtl催化的0-Ac-ADPR的形成可以被檢測(cè) 出來。當(dāng)用32P_NAD和Sirt5孵育被胰蛋白酶消化的牛肝臟線粒體肽時(shí)形成0-Su-ADPR(條 帶9)，但用Sirtl則不能形成（條帶10)，這表明琥珀酰賴氨酸殘基存在于牛肝臟線粒體肽 提取物中。作為對(duì)照組的用BSA肽和Sirt5的反應(yīng)不會(huì)產(chǎn)生0-Su-ADPR(條帶12)。⑶38 能水解NAD產(chǎn)生ADPR，它被用來產(chǎn)生在第13條帶上的標(biāo)準(zhǔn)32P-ADPR點(diǎn)。（B)Sirt5的缺失 可以增加老鼠肝臟部位的CPS1琥珀酰水平。在野生型或Sirt5敲除的肝臟中免疫沉淀出 CPS1，用32P-NAD檢測(cè)出琥珀?；?。合成的乙酰，丙二酰和琥珀酰肽可被用來分別產(chǎn)生 對(duì)照點(diǎn) 0-Ac-ADPR，0-Ma-ADPR和 0-Su-ADPR。
[0016] 圖5A-5C:Sirtl和Sirt5催化的H3K9肽㈧脫乙?；敲摫；停–)脫 琥珀酰化通過HPLC被檢測(cè)（檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm)。一個(gè)更長(zhǎng)的HPLC柱被用于更好地分離酰 基肽和脫?；?。結(jié)果進(jìn)一步表明Sirtl有更好的脫乙?；钚?，而Sirt5有更好的脫丙二 酰和脫琥珀?；钚浴?br>[0017] 圖6A-6B: (A)表示Sirtuin催化的NAD依賴的脫?；磻?yīng)，這個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生0-酰 基-ADP-核糖。（B)sirtuin催化的NAD依賴的脫乙?；臋C(jī)理。
[0018] 圖7A-7D :0-丙二酰-ADPR的⑷和0-琥珀酰-ADPR⑶的HPLC純化及MS確認(rèn) (C和D)。在A和B中的黑色曲線是Sirt5催化的H3K9?；拿摫；兔撶牾；?的HPLC曲線（檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm)。用Sirtl孵育的肽沒有產(chǎn)生相同的產(chǎn)物（灰色曲線）。 o-丙二酰-ADPR(C)和0-琥珀酰-ADPR(D)進(jìn)一步通過MALDI-MS分析。0-丙二酰-ADPR和0-琥珀酰-ADPR的形成表明Sirt5催化的反應(yīng)機(jī)制和第一類的脫乙?；傅拿撘阴；?機(jī)制相同。
[0019] 圖8 :Sirt5催化的脫丙二酰和脫琥珀酰反應(yīng)。
[0020] 圖9 :受保護(hù)的硫代琥珀酰賴氨酸化合物的合成，被用于制備H3K9TSu肽。
[0021] 圖10 :AMC-琥珀酰肽的合成。
[0022] 圖11:ISGASE(SuK)-AMC是Sirt5的底物。ISGASE(SuK)-AMC肽在有或沒有Sirt5 下孵育4小時(shí)，然后加1yg胰蛋白酶孵育3小時(shí)。與沒有Sirt5的陰性對(duì)照相比，1，2,和 5以1的31竹5使熒光分別增加11，20，和26倍。
[0023] 圖 12 :SGASE(SuK)-AMC不是Sirtl，2,和 3 的底物。ISGASE(SuK)-AMC肽用 1yM 不同的去乙?；阜跤?小時(shí)，然后用1yg胰蛋白酶孵育3小時(shí)。與沒有去乙?；傅年?性對(duì)照相比，只有使用Sirt5的熒光才增強(qiáng)。
[0024] 圖13:使用熒光底物ISGASE(SuK)-AMC篩選Sirt5抑制劑。沒有Sirt5和有Sirt5， 但是不加小分子的反應(yīng)做對(duì)照組。所有小分子的濃度為30yM。H3K9TSu和suramin表現(xiàn) 出顯著的Sirt5抑制活性。
[0025]圖 14 :ISGASE(AcK)-AMC是Sirt2 底物。ISGASE(AcK)-AMC肽用 1yM不同的去乙 ?；阜跤?0小時(shí)，然后加入1yg胰蛋白酶孵育3小時(shí)。與沒有去乙?；傅年幮詫?duì)照 相比，Sirt2增強(qiáng)熒光最多，但Sirt5和Sirt3沒有顯著增強(qiáng)熒光。
[0026] 圖15:使用ISGASE(AcK)-AMC和Sirt2篩選發(fā)現(xiàn)H3K9TSu而不是蘇拉明 (suramin)是Sirt5特異性的抑制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0027] 去乙酰化酶（Sirtuins)是一類進(jìn)化保守的酶，與很多生物功能有關(guān)。Sirtsl-3被 認(rèn)為有強(qiáng)的脫乙?；钚裕窃诒景l(fā)明公開之前，Sirts4-7沒有被發(fā)現(xiàn)有強(qiáng)的酶活性。比 如，Sirt5的脫乙?；钚匀酰涿撘阴５男ЯΡ萐irtl低500倍。
[0028] 本發(fā)明第一次發(fā)現(xiàn)Sirt5對(duì)丙二酰和琥珀酰肽比對(duì)乙酰肽具有更顯著的水解活 性。進(jìn)一步說，本發(fā)明表明在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在蛋白賴氨酸琥珀酰化和丙二?；?。另外， 在Sirt5敲除的小鼠組織中，觀察到CPS1 (-個(gè)已知的Sirt5靶蛋白）的賴氨酸琥珀?；?平增高。因此，可以認(rèn)為Sirt5在體內(nèi)的主要活性是脫琥珀酰和脫丙二酰，而不是脫乙酰。
[0029] 本發(fā)明的研究者發(fā)現(xiàn)了Sirt5的強(qiáng)酶活性，使開發(fā)鑒別Sirt5特異性調(diào)節(jié)劑的方 法成為可能。Sirt5特異性調(diào)節(jié)劑可被用于研究Sirt5的生物功能，可以祀向Sirt5活性用 于治療人類疾病。
[0030]Sirt5 活性
[0031] 本發(fā)明中使用的"Sirt5活性"包括酶去除賴氨酸殘基上的酰基（丙二酰，琥珀酰， 戊二酰和乙酰）。所以，Sirt5活性包括賴氨酸殘基的脫丙二酰，脫琥珀酰，脫戊二酰和脫乙 酰。
[0032] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，公開了Sirt5獨(dú)特的脫琥珀酰和脫丙二?；钚?。 "Sirt5脫琥珀?；钚?是指Sirt5酶去除賴氨酸殘基上的琥珀?；?。"Sirt5脫丙二?；?性"是指Sirt5酶去除賴氨酸殘基上的丙二酰基。
[0033]Sirt5能作用于孤立的帶有?；馁嚢彼釟埢?，或者是作用于在肽或蛋白中的酰 基化的賴氨酸殘基。Sirt5活性，比如，脫琥珀酰和脫丙二?；钚钥梢园l(fā)生在體內(nèi)作為對(duì)含 有琥珀?；虮Ｙ嚢彼岬牡鞍追g后進(jìn)行修飾，使得下游生理反應(yīng)的產(chǎn)生。
[0034] "Sirt5調(diào)節(jié)劑"或"Sirt5調(diào)控劑"或"Sirt5調(diào)控化合物"是可以激活或抑制Sirt5 活性的底物。"Sirt5抑制劑"是可以降低或阻止Sirt5活性的底物。"Sirt5激活劑"是可 以提尚或促進(jìn)Sirt5活性的底物。
[0035] 檢測(cè)Sirt5活性的方法
[0036] 一方面，本發(fā)明公開了一種在樣本中檢測(cè)Sirt5脫丙二酰，脫琥珀?；蛎撐於?活性水平的實(shí)驗(yàn)。
[0037] 上述實(shí)驗(yàn)基于含有丙二酰，琥珀酰，或戊二酰賴氨酸的底物。所述賴氨酸連接指示 劑部分，所述賴氨酸和指示劑部分間的連接可以被裂解劑裂解，所述裂解劑對(duì)賴氨酸殘基 的丙二?；牾；蛭於；癄顟B(tài)敏感。因此，當(dāng)所述底物在能被Sirt脫丙二?；?，脫 琥珀?；蛎撐於；沫h(huán)境下與Sirt5接觸時(shí)，?；娜コ赡軐?dǎo)致裂解部位的暴露） 允許裂解劑作用于裂解部位，然后釋放指示劑部分，產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。
[0038] 用于在實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)Sirt5活性的合適底物可以是任何含有琥珀酰，丙二?；蛭於?酰賴氨酸殘基的分子，包括孤立的賴氨酸殘基或者是含有賴氨酸的肽。在具體的實(shí)施例中， 用于實(shí)驗(yàn)的底物是含有琥珀?；虮Ｙ嚢彼釟埢碾模⑦B接有指示劑部分。
[0039] 本發(fā)明所使用的術(shù)語"肽"包括通過肽鍵相連的2個(gè)或者更多氨基酸。對(duì)肽的鏈長(zhǎng) 沒有特別限制。所述肽鏈短到可以是4到5個(gè)氨基酸，也可以長(zhǎng)到50個(gè)氨基酸或者更長(zhǎng)。 在一些實(shí)施例中，被用于方法的肽的長(zhǎng)度是15到25個(gè)氨基酸。除了肽一般在C端包括琥 珀酰，丙二酰或戊二酰賴氨酸外，對(duì)肽的氨基酸序列也沒有特別的限制。優(yōu)選的，所述肽底 物在丙二?；蜱牾Ｙ嚢彼釟埢皼]有賴氨酸或者精氨酸殘基，這樣一旦去除琥珀?；?丙二?；?，在琥珀?；虮Ｙ嚢彼岷椭甘緞┎糠珠g的連接（比如酰氨鍵）可以被裂解劑 有效地作用。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述肽鏈具有序列異亮氨酸-絲氨酸-甘氨酸-丙氨 酸-絲氨酸-谷氨酸-賴氨酸（ISGASEK，SEQIDN0:1)，其中所述的賴氨酸是酰化的（琥珀 ?；?，丙二?；蛭於；?br>[0040] 不管是孤立的還是作為肽的一部分，所述丙二酰，琥珀?；蛭於Ｙ嚢彼岷椭甘?劑部分連接。所述連接是共價(jià)連接，在賴氨酸的酰基被去除后可以被裂解劑裂解。比如，所 述共價(jià)連接是一個(gè)酰胺鍵，形成于丙二酰，琥珀酰或戊二酰賴氨酸羧基和指示劑化合物的 氨基之間，在賴氨酸的?；蝗コ螅ū热?，導(dǎo)致所述肽鍵向蛋白水解酶暴露）易被蛋白水 解酶裂解。
[0041] 所述裂解劑可以是任何能可預(yù)見性地裂解在特定氨基酸殘基之間肽的試劑（比 如蛋白水解的裂解方式），但是在賴氨酸被琥珀酰化，丙二?；蛘呶於；瘯r(shí)不能裂解肽 鍵。如一個(gè)實(shí)施例所述，裂解劑是蛋白水解酶，比如可以水解肽鍵的酶（也指肽酶）。所述 的蛋白水解酶包括但不限于胰蛋白酶，鈣蛋白酶，賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶，賴氨酸-C蛋白內(nèi)切 酶，金屬肽鏈內(nèi)切酶，血纖維蛋白溶酶，羧肽酶，胰凝乳蛋白酶，V8蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋 白酶，枯草桿菌蛋白酶，凝血酶，彈性蛋白酶，gluc_C，endolys-C或者蛋白酶K，半胱天冬 酶-1，半胱天冬酶-2,半胱天冬酶-3,半胱天冬酶-4,半胱天冬酶-5,半胱天冬酶-6,半胱 天冬酶-7,半胱天冬酶-8,MetAP-2,腺病毒蛋白酶，HIV蛋白酶等。
[0042] 在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述裂解劑是胰蛋白酶。胰蛋白酶水解肽鍵，所述肽鍵的 羧基來自賴氨酸和精氨酸殘基；因此，胰蛋白酶可以裂解Sirt5底物的賴氨酸殘基的羧基 末端的肽。另外一種合適的裂解劑是胃蛋白酶，它能水解在丙基苯氨酸，色氨酸和酪氨酸殘 基的氨基末端的肽鍵。因此，所述胃蛋白酶可以裂解賴氨酸殘基和鄰近的丙基苯氨酸，色氨 酸或酪氨酸殘基之間的底物肽。
[0043] 在這些實(shí)驗(yàn)中，Sirt5酶活性是通過蛋白水解消化，用裂解劑從肽上裂解指示劑部 分，產(chǎn)生一個(gè)可檢測(cè)的信號(hào)。
[0044] "指示劑部分"是能檢測(cè)到Sirt5活性的分子或Sirt5底物的組分。指示劑部分或 許可以是，比如，熒光或其他標(biāo)記分子，比如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC)，F(xiàn)LAG，或聚組氨 酸抗體標(biāo)簽。在具體實(shí)施例中，所述指示