一種恩拉霉素的提純方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于抗生素純化領(lǐng)域，主要涉及一種恩拉霉素的提純方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 恩拉霉素（enramycin)又名恩來霉素、恩霉素、安來霉素、持久霉素，是由包括13 個不同種類的17個氨基酸分子和脂肪酸分子所組成的多肽類抗生素，其中氨基酸分子構(gòu) 成環(huán)狀多肽結(jié)構(gòu)，脂肪酸位于多肽結(jié)構(gòu)末端。根據(jù)其末端脂肪酸種類不同，分為恩拉霉素 A和恩拉霉素B，恩拉霉素主要是由這兩種成分組成。恩拉霉素對革蘭氏陽性菌有顯著抑 菌作用，不易產(chǎn)生抗藥性，能夠改變腸道內(nèi)的細(xì)菌菌落分布，有利于飼料營養(yǎng)成分的消化吸 收，具有很好的促生長效果。恩拉霉素鹽酸鹽為白色結(jié)晶粉末，易溶于二甲基亞砜、可溶于 甲醇、含水乙醇，難溶于丙酮，不溶于苯、氯仿。恩拉霉素鹽酸鹽對熱、光照和潮濕有極好的 穩(wěn)定性。
[0003] 中國專利CN101597578A公布了一種利用大孔樹脂分離純化恩拉霉素的方法，該 方法所獲得的產(chǎn)品含量較低。中國專利CN102391363A公布的提純方法其含量也低于90%。 為了提高恩拉霉素的含量，也出現(xiàn)多種方法聯(lián)合使用純化恩拉霉素的方法，利用大孔樹脂 與反相制備色譜聯(lián)合使用制備高含量恩拉霉素的方法（《大孔樹脂吸附與反相色譜純化恩 拉霉素》，《生物工程學(xué)報》，2014, 30 (11) : 1701-1708)，但該方法的缺陷在于成本高昂，步驟 繁瑣，難于操作。
[0004] 因此，目前本領(lǐng)域需要提供一種成本低廉、操作簡便、恩拉霉素含量高的恩拉霉素 的提純方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種利用硅膠柱層析純化獲得恩拉 霉素的新方法，以克服現(xiàn)有恩拉霉素提純工藝存在的一系列問題。
[0006]本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)解決方案實(shí)現(xiàn)的。
[0007]本發(fā)明提供了一種恩拉霉素的提純方法，所述提純方法包括：
[0008]利用鹽酸調(diào)整甲醇與恩拉霉素閃蒸粉混合物的pH值至酸性獲得恩拉霉素提取 液，再調(diào)整所述恩拉霉素提取液的pH值至中性，以柱層層析硅膠為分離介質(zhì)，以石油醚、乙 酸乙酯、乙酸丁酯、甲醇、作為洗脫液依次洗脫去除雜質(zhì)，再使用鹽酸的甲醇溶液將恩拉霉 素洗脫獲得含有恩拉霉素的洗脫液，將所述含有恩拉霉素的洗脫液的pH調(diào)整至中性后，旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥得到恩拉霉素。
[0009] 可選的，所述提純方法包括以下步驟：
[0010] (1)將恩拉霉素與甲醇進(jìn)行第一接觸后獲得混合物1，用鹽酸的甲醇溶液調(diào)節(jié)混 合物1的pH至1. 0-4. 0后離心收集上清獲得恩拉霉素提取液，調(diào)節(jié)所述恩拉霉素提取液的 pH至6. 5-8. 5后與柱層層析硅膠進(jìn)行第二接觸獲得混合物2,將混合物2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后 干法上柱獲得娃I父柱；
[0011] (2)依次利用石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲醇作為洗脫液對步驟（1)獲得的硅 膠柱進(jìn)行洗脫，獲得去除雜質(zhì)后的硅膠柱；
[0012] (3)利用鹽酸的甲醇溶液對去除雜質(zhì)后的硅膠柱進(jìn)行洗脫，收集獲得含有恩拉霉 素的洗脫液；
[0013] (4)將所述含有恩拉霉素的洗脫液的pH值調(diào)節(jié)至6. 5-8. 5后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥。
[0014] 可選的，在所述步驟（1)中：調(diào)節(jié)混合物1的pH值至2-3. 5,調(diào)節(jié)所述恩拉霉素提 取液的pH至7-7. 5。
[0015] 可選的，所述鹽酸的甲醇溶液中鹽酸的濃度為0. 1-lmol/L。
[0016] 可選的，在步驟（1)和步驟（4)中，利用濃度為0. 1-lmol/L的氫氧化鈉的甲醇溶 液或濃度為〇. 1-lmol/L的氫氧化鉀的甲醇溶液對所述恩拉霉素提取液和所述含有恩拉霉 素的洗脫液的pH值進(jìn)行調(diào)整。
[0017]可選的，在所述步驟（1)中，恩拉霉素提取液與柱層層析硅膠的混合比例為：以恩 拉霉素提取液中干物質(zhì)的質(zhì)量為基準(zhǔn)，加入3-6倍質(zhì)量的柱層層析硅膠。
[0018] 可選的，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥的溫度控制在35-50°C。
[0019] 可選的，在步驟（2)中：在洗脫開始時采用石油醚作為第一雜質(zhì)洗脫液，洗脫1-3 個柱體積；然后使用乙酸乙酯作為第二雜質(zhì)洗脫液，洗脫1-3個柱體積；隨后使用乙酸丁酯 作為第三雜質(zhì)洗脫液，洗脫1-3個柱體積；最后使用甲醇作為第四雜質(zhì)洗脫液，洗脫5-15個 柱體積。
[0020] 可選的，所述第一接觸中，相對于100g的所述恩拉霉素閃蒸粉，甲醇的用量為 0.3-lL〇
[0021] 可選的，在步驟（3)中以鹽酸的甲醇溶液對去除雜質(zhì)后的硅膠柱進(jìn)行洗脫，洗脫 3-10個柱體積。
[0022] 本發(fā)明根據(jù)恩拉霉素的理化性質(zhì)及雜質(zhì)情況，尋找到了適合恩拉霉素提純的方 法。本發(fā)明所提供的方法可以有效去除雜質(zhì)，克服現(xiàn)有恩拉霉素提純方法的缺陷，實(shí)驗(yàn)證 明，應(yīng)用本發(fā)明提供的方法制備恩拉霉素，其含量可以達(dá)到98%以上。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 本發(fā)明提供了一種恩拉霉素的提純方法，所述提純方法包括：
[0024] 利用鹽酸調(diào)整甲醇與恩拉霉素閃蒸粉混合物的pH值至酸性獲得恩拉霉素提取 液，再調(diào)整所述恩拉霉素提取液的pH值至中性，以柱層層析硅膠為分離介質(zhì)，以石油醚、乙 酸乙酯、乙酸丁酯、甲醇、作為洗脫液依次洗脫去除雜質(zhì)，再使用鹽酸的甲醇溶液將恩拉霉 素洗脫獲得含有恩拉霉素的洗脫液，將所述含有恩拉霉素的洗脫液的pH調(diào)整至中性后， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥得到恩拉霉素。
[0025] 其中，所述恩拉霉素閃蒸粉是將恩拉霉素發(fā)酵液直接進(jìn)行閃蒸所得固體。閃蒸粉 中恩拉霉素的含量約為7-8% (質(zhì)量）。
[0026] 在本發(fā)明所提供的方法中，本發(fā)明的提純方法可以包括以下步驟：
[0027] (1)將恩拉霉素與甲醇進(jìn)行第一接觸后獲得混合物1，用鹽酸的甲醇溶液調(diào)節(jié)混 合物1的pH至1. 0-4. 0后離心收集上清獲得恩拉霉素提取液，調(diào)節(jié)所述恩拉霉素提取液的 pH值至6.5-8. 5后與柱層層析硅膠進(jìn)行第二接觸獲得混合物2,將混合物2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥 后干法上柱獲得娃I父柱；
[0028] (2)依次利用石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲醇作為洗脫液對步驟⑴獲得的硅 膠柱進(jìn)行洗脫，獲得去除雜質(zhì)后的硅膠柱；
[0029] (3)利用鹽酸的甲醇溶液對去除雜質(zhì)后的硅膠柱進(jìn)行洗脫，收集獲得含有恩拉霉 素的洗脫液；
[0030] (4)將所述含有恩拉霉素的洗脫液的pH值調(diào)節(jié)至6. 5-8. 5后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥。
[0031] 可選的，在步驟（1)中：調(diào)節(jié)混合物1的pH值至2-3. 5,調(diào)節(jié)所述恩拉霉素提取液 的pH至 7-7. 5。
[0032] 在本發(fā)明所提供的方法中，所述鹽酸的甲醇溶液中鹽酸的濃度為0. 1-lmol/L。
[0033] 其中，在第一接觸中，相對于100g的所述恩拉霉素閃蒸粉，甲醇的用量為0. 3-1L。
[0034] 在步驟⑴和步驟⑷中，利用濃度為0. 1-lmol/L的氫氧化鈉的甲醇溶液或濃度 為0. 1-lmol/L的氫氧化鉀的甲醇溶液對所述恩拉霉素提取液和所述含有恩拉霉素的洗脫 液的pH值進(jìn)行調(diào)整。
[0035] 其中，所述步驟（1)中，恩拉霉素提取液與柱層層析硅膠的混合比例為：以恩拉霉 素提取液中干物質(zhì)的質(zhì)量為基準(zhǔn)，加入3-6倍質(zhì)量的柱層層析硅膠。
[0036] 其中，所述干物質(zhì)的質(zhì)量是通過以下方式測量得到的：先稱量旋蒸瓶的質(zhì)量，隨后 利用該旋蒸瓶旋蒸中性恩拉霉素提取液，待不再有液體被蒸出時，稱量此時旋蒸瓶的質(zhì)量， 兩個質(zhì)量相減所得質(zhì)量即為干物質(zhì)質(zhì)量。干物質(zhì)呈粘稠狀液體，含有恩拉霉素及大量雜質(zhì)。
[0037] 在生產(chǎn)中，可以將所述干物質(zhì)用適量甲醇復(fù)溶，超聲振蕩充分溶解，再加入層析硅 膠旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥。
[0038] 可選的，所述柱層層析硅膠的規(guī)格為100目-300目。
[0039] 其中，在上柱時，與恩拉霉素提取液混合的柱層層析硅膠與硅膠柱中填充的柱層 層析硅膠之間的質(zhì)量比為5:1-3:1。
[0040] 其中，所述旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溫度為35-50°C。
[0041] 可選的，在步驟⑵中：
[0042] 包括利用極性大小不同的洗脫液依次洗脫以去除恩拉霉素提取液中的雜質(zhì)。
[0043] 其中，在步驟（2)中，還包括在洗脫前利用石油醚對裝填后的硅膠層析柱進(jìn)行潤 洗。
[0044] 所述洗脫液依次為石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲醇。
[0045] 在洗脫開始時采用石油醚作為第一雜質(zhì)洗脫液，洗脫1-3個柱體積；然后使用乙 酸乙酯作為第二雜質(zhì)洗脫液，洗脫1-3個柱體積；隨后使用乙酸丁酯作為第三雜質(zhì)洗脫液， 洗脫1-3個柱體積；最后使用甲醇作為第四雜質(zhì)洗脫液，洗脫5-15個柱體積。優(yōu)選地，在洗 脫過程中以高效液相色譜監(jiān)測洗脫液中的恩拉霉素。
[0046] 在步驟（3)中以鹽酸的甲醇溶液對去除雜質(zhì)后的硅膠柱進(jìn)行洗脫，洗脫3-10個柱 體積。優(yōu)選地，在洗脫過程中以高效液相色譜監(jiān)測洗脫液中的恩拉霉素。
[0047] 步驟（4)后收集到的含有恩拉霉素的洗脫液經(jīng)調(diào)節(jié)pH值至中性后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)， 得到固體恩拉霉素，隨后將固體恩拉霉素水洗打漿，抽濾后將濾餅烘干得到高含量恩拉霉 素。
[0048] 可選的，所述步驟（4)中：將恩拉霉素洗脫液1的pH值調(diào)節(jié)至6. 5-8. 5,優(yōu)選 為7-7. 5后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溫度為35-50°C。調(diào)節(jié)pH值使用的溶液為濃度為0. 1-lmol/L的氫氧化鈉的甲醇溶液或者濃度為0.1-lmol/L的氫氧化鉀的甲醇溶液。
[0049] 本發(fā)明所提供的方法中，對于接觸的方式?jīng)]有特別的限制，只要能夠使得各組分 混合均勻即可。
[0050] 另一方面，本發(fā)明還提供通過上述提純方法得到的恩拉霉素。所得到的恩拉霉素 含量達(dá)到98%以上。
[0051] 以下參照具體的實(shí)施例來說明本實(shí)驗(yàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅 用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0052] 下述實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的藥材原 料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產(chǎn)品。
[0053] 以下實(shí)施例中閃蒸粉由山東勝利生物工程有限公司提供，恩拉霉素含量為7-8%。
[0054] 實(shí)施例1
[0055] 將500g恩拉霉素閃蒸粉與1. 5L甲醇充分混合獲得混合物，利用0.lmol/L鹽酸的 甲醇溶液將混合物的pH至調(diào)節(jié)至1. 0,充分振蕩，在3000rpm離心30min取得上清液制成恩 拉霉素提取液，利用0.lmol/L的氫氧化鈉的甲醇溶液將提取液的pH調(diào)節(jié)至6. 5,其干物質(zhì) 的質(zhì)量約為50g(先稱量旋蒸瓶的質(zhì)量，隨后利