E3-pGEX-durAB_H37A，PCR鑒定電泳分析如圖2。菌株DE3-pGEX-durAB-H37A表達(dá)耐久腸球菌素突變體H37A。
[0036]采用上述相同方法，構(gòu)建表達(dá)突變體R43A的突變重組菌DE3-pGEX-durAB-R43A。突變體R43A是將耐久腸球菌素Durancin GL氨基酸序列(SEQ ID NO:1)第43位R(精氨酸)采用A(丙氨酸)取代后獲得的。耐久腸球菌素突變體R43A的氨基酸序列如SEQ IDN0:5，編碼基因的序列如SEQ ID N0:6所示。
[0037]其中使用的突變引物為R43A-F(SEQID NO: 11)和R43A_R(SEQ ID N0:12)，具體序列如下:
[0038]R43A-F:5’-AACATGGACCTTGGGCTCCTGCATAGAAAGGATTAGTT-3’ ，
[0039]R43A-R:
[0040]5’-GCAGGAGCCCAAGGTCCATGTTGCACCCAACCATTAACA-3’ 。
[0041 ] 另外，將重組質(zhì)粒pGEX-durAB轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta (DE3)，獲得表達(dá)耐久腸球菌素 Durancin GL 的菌株 DE3-pGEX_durAB。
[0042]實(shí)施例2制備突變體
[0043]以I %接種量將表達(dá)菌株DE3-pGEX-durAB-H37A接入含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)至OD6。。為0.6?0.8，向培養(yǎng)液中加入終濃度為lmmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)5?6h。將發(fā)酵液在8000g條件下離心5min收集菌泥，用生理鹽水清洗菌泥2次。用I %初始培養(yǎng)基體積的結(jié)合緩沖液(含有140mMNaCl、2.7mM KClUOmM Na2HPO4^P 1.8mM KH2PO4的水溶液，pH7.4)懸浮菌體，置于冰水混合物中超聲破碎菌體細(xì)胞至溶液澄清，超聲參數(shù)為:400W超聲2s間隙9s。將菌體裂解液在4°C、15000r/min條件下離心30min，上清液經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾，得到細(xì)菌素融合蛋白粗提液。將細(xì)菌素融合蛋白粗提液采用HisTrap HP柱(購自GE公司)進(jìn)行純化，洗脫緩沖液是含有500mM NaCl、20mM Na3PO4^P 500mM咪唑的水溶液(pH7.4)，收集洗脫峰，然后采用HiTrap? Desalting 5ml柱(購自GE公司)脫鹽。按照生工生物工程(上海)股份有限公司腸激酶(Cat.N0.RP005)操作說明書對(duì)上述分離純化的融合蛋白做酶切處理，采用HisTrap HP柱除去His標(biāo)簽，獲得耐久腸球菌素突變體H37A。
[0044]分別采用DE3-pGEX-durAB和突變重組菌DE3-pGEX_durAB-R43A，按照上述相同方法制備耐久腸球菌素Durancin GL和突變體R43A。
[0045]實(shí)施例3突變體的性質(zhì)
[0046]考察實(shí)施例2制備的各突變體性質(zhì)，其中耐久腸球菌素Durancin GL由實(shí)施例2中方法制備。
[0047](I)活性
[0048]以單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)為指示菌檢測(cè)耐久腸球菌素突變體H37A、R43A 的抑菌活性，具體方法見參考文獻(xiàn)(Lihui Du, George A.Somkuti, John A.RenyeJr.Guicheng Hu0.2012.Properties ofDurancin GL, a new antilisterial bacter1cinproduced by Enterococcus Durans 4ID.Journal offood safety, 32:74-83.)。其中，耐久腸球菌素Durancin GL、突變體的濃度相同(均為20 μ g/mL)，滴加的體積均為5 μ I。從圖3可以看出，突變體Η37Α、R43A對(duì)單增李斯特菌的抑菌活性分別為耐久腸球菌素DurancinGL的1.9倍和2.1倍。
[0049](2)穩(wěn)定性
[0050]以單增李斯特菌為指示菌對(duì)耐久腸球菌素Durancin GL、突變體Η37Α、R43A的溫度和pH穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，具體方法見參考文獻(xiàn)(Meizhong ；H, Haizhen ；Z, Chong ；Z,et al.Purificat1n and Characterizat1n of Plantaricin 163,a NovelBacter1cin Produced by Lactobacillus piantarum 163Isolated from Tradit1nalChinese Fermented Vegetables[J].Journal ofAgricultural and Food Chemistry, 2013,61(47): 11676—82.)。
[0051 ] 溫度穩(wěn)定性檢測(cè)中，將耐久腸球菌素Durancin GL和突變體分別在4°C?121°C范圍內(nèi)處理30min后檢測(cè)抑制單增李斯特菌活性，計(jì)算突變體相對(duì)活力:處理后的突變體與25°C條件下未經(jīng)處理的同一突變體對(duì)單增李斯特菌抑菌活性之比。耐久腸球菌素DurancinGL相對(duì)活力的計(jì)算方法同突變體。
[0052]pH穩(wěn)定性檢測(cè)中，將耐久腸球菌素Durancin GL和突變體分別在pH 2?14條件下30min后檢測(cè)抑制單增李斯特菌活性。計(jì)算突變體相對(duì)活力:處理后的突變體與pH7條件下未經(jīng)處理的同一突變體對(duì)單增李斯特菌抑菌活性之比。耐久腸球菌素Durancin GL相對(duì)活力的計(jì)算方法同突變體。
[0053]結(jié)果如圖4和5。耐久腸球菌素Durancin GL、突變體H37A、R43A的溫度穩(wěn)定性基本相同。突變體H37A、R43A的pH穩(wěn)定性顯著高于耐久腸球菌素Durancin GL0耐久腸球菌素Durancin GL在ρΗ7.0條件下活力最大，在pH 14條件下處理半小時(shí)后相對(duì)活力僅為0.6，其他pH條件下處理半小時(shí)后相對(duì)活力約為0.81 ;突變體H37A在pH 4?12范圍內(nèi)處理后，相對(duì)活力約為1.0，在pH 14條件下處理半小時(shí)后相對(duì)活力仍然達(dá)到0.8。突變體R43A在pH 8?12范圍內(nèi)處理后，相對(duì)活力約為1.0，在pH 14條件下處理半小時(shí)后相對(duì)活力仍然達(dá)到0.75。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.耐久腸球菌素突變體，其氨基酸序列如SEQID N0:2或SEQ ID N0:5所示。2.權(quán)利要求1所述耐久腸球菌素突變體的編碼基因。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述編碼基因，其特征在于所述編碼基因的序列如SEQID N0:3或SEQ ID NO:6 所示。4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或細(xì)胞系。5.制備權(quán)利要求1所述耐久腸球菌素突變體的方法，包括如下步驟:將攜帶有耐久腸球菌素突變體編碼基因的載體導(dǎo)入宿主菌，誘導(dǎo)所述宿主菌表達(dá)耐久腸球菌素突變體。6.權(quán)利要求1所述耐久腸球菌素突變體在制備食品級(jí)防腐劑方面的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供耐久腸球菌素突變體、編碼基因及其應(yīng)用，涉及食品領(lǐng)域。耐久腸球菌素突變體，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO:2或SEQ？ID？NO:5所示。本發(fā)明還要求保護(hù)所述耐久腸球菌素突變體的編碼基因、和在制備食品級(jí)防腐劑方面的應(yīng)用。所述制備方法包括如下步驟：將攜帶有耐久腸球菌素突變體編碼基因的載體導(dǎo)入宿主菌，誘導(dǎo)所述宿主菌表達(dá)耐久腸球菌素突變體。本發(fā)明耐久腸球菌素突變體H37A和R43A均具有較高活性和穩(wěn)定性，制備方法簡(jiǎn)單，有望應(yīng)用于食品級(jí)防腐劑。
【IPC分類】C12N1/21, C12N15/31, C12N15/70, C07K14/315
【公開號(hào)】CN105037511
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510406757
【發(fā)明人】都立輝, 鞠興榮, 陳信全, 吳學(xué)友, 袁建, 何榮, 劉凌平, 和肖營(yíng)
【申請(qǐng)人】南京財(cái)經(jīng)大學(xué)
【公開日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年7月10日