一種鎘-IgE螯合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測領域，更具體地說，涉及一種鎘-IgE螯合物及其制備方法和應 用。
【背景技術】
[0002] IgE主要由粘膜相關淋巴樣組織產(chǎn)生，其中大部分是由胃腸淋巴樣組織所合成，少 部分由呼吸道、唾液腺和生殖道粘膜組織合成。哺乳期產(chǎn)婦腺組織含有大量IgE產(chǎn)生細胞， 這些細胞主要來自胃腸。在人類，還有少量的IgE來自骨髓。人出生后4~6月開始合成 IgE，4~12歲血清中含量達成人水平，血清型IgE總Ig的10 %左右，半衰期約5~6天。 IgE有IgEl和IgE2兩個亞類。IgEl主要存在于血清中，約占血清中IgE的85%，a 1鏈分 子量為56kD ;IgE2主要存在于外分泌液中，少部分以血清型IgE存在，約占血清中IgE的 15%，a 2鏈缺乏鉸鏈區(qū)，分子量為52kD。血清中的IgE除單體形式外還有由J鏈共價相連 的二聚體或三聚體等形式。分泌型IgE是由J連接的雙體和分泌成分所組成，主要存在于 初乳、唾液、淚液、胃腸液、支氣管分泌等外分泌液中，是粘膜局部免疫的最重要因素，分泌 型IgE通過與相應的病原微生物（如脊髓灰質(zhì)炎病毒）結合，阻抑其吸附到易感細胞上，分 泌型IgE還可中和毒素如霍亂弧菌毒素和大腸桿毒素等。新生兒易患呼吸道、胃腸道感染 可能與IgE合成不足有關。慢性支氣管炎發(fā)作與分泌型IgE的減少也有一定關系。產(chǎn)婦可 通過初乳將分泌型IgE傳遞給嬰兒，這也是一種重要的自然被動免疫。嗜酸性粒細胞、中性 粒細胞和巨噬細胞表達Fc a R，血清型單體IgE可介導調(diào)理吞噬和ADCC作用。此外，分泌 型IgE具有免疫排除功能，即分泌型IgE結合飲食中大量的可溶性抗原以及腸道正常菌群 或病原微生物所釋放的熱原物質(zhì)，防止它們進入血液。
[0003] 鎘是一種常見的有毒金屬及環(huán)境污染物，廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中，包括電鍍、 制造工業(yè)顏料、塑料穩(wěn)定劑、鎳鉻電池等，與人們生活息息相關。對于普通人群，主要是通過 吸入鎘污染的空氣，及食用含鎘污水灌溉農(nóng)田生產(chǎn)的農(nóng)作物（如含鎘大米）等方式攝入鎘。 當然，吸煙也是慢性鎘吸入的另一重要來源。隨著經(jīng)濟的飛速發(fā)展，鎘污染對于人類的影 響越來越大。通過研究鎘對小鼠子代體液免疫的影響發(fā)現(xiàn)了染鎘21天仔鼠的血清溶血素 滴度明顯低于對照組；4周齡時高鎘組、低鎘組、對照組仔鼠間血清溶血素滴度沒有顯著差 異；8周齡時，低鎘組仔鼠血清溶血素滴度與對照組相比明顯升高，表現(xiàn)出刺激作用，而高 鎘組卻與對照組無顯著差異，表現(xiàn)免疫反應受到抑制。鎘對子代小鼠的免疫影響是在尚未 發(fā)生母體中毒作用的情況下產(chǎn)生的，對仔鼠的生長發(fā)育也未見明顯影響?？梢姲l(fā)育中的免 疫系統(tǒng)對鎘較敏感，提示可考慮將子代免疫指標作為研究鎘的發(fā)育毒性作用的指標之一。
[0004] 鎘與多種蛋白質(zhì)之間關系密切，可以與多種蛋白質(zhì)結合，抑制多種蛋白酶的活性。 隨著對鎘毒性研究的深入，人們逐漸認識到鎘與蛋白的相互作用在其致毒過程中扮演著重 要的角色，被認為是了解鎘的毒性機理的關鍵所在，因此，對鎘和蛋白質(zhì)相互作用的研究就 顯得愈發(fā)重要。而現(xiàn)在關于鎘與蛋白質(zhì)作用的機理僅是冰山一角，還有很多蛋白質(zhì)與鎘之 間的關系還不清楚，因而加強對于鎘與蛋白質(zhì)之間的關系至關重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對鎘污染嚴重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種鎘-IgE螯合物及其制備方 法，并建立鎘-IgE螯合物的定性、定量檢測方法，以便定量檢測鎘-IgE螯合物在評價一個 地區(qū)鎘污染程度的應用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中鎘-IgE螯合物可以間接反映 這個地區(qū)人群受鎘污染的情況，從而間接反映這個地區(qū)鎘污染程度。
[0006] 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：提供一種鎘-IgE螯合物，鎘離子與 IgE通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成。
[0007] 本發(fā)明還提供一種上述的鎘-IgE螯合物的制備方法，包括以下步驟：
[0008] A)鎘與IgE的螯合反應：在提純源于人體的IgE或按照生物學方法重組的IgE中 加入鎘離子進行螯合反應，得到反應溶液；
[0009] B)純化鎘-IgE螯合物的提?。翰捎妹庖哂H和層析法，去除反應溶液中未反應的 IgE以及多余的鎘離子，即得鎘-IgE螯合物。
[0010] 其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下：
[0011] (1)溶解樣品：向經(jīng)過步驟A)得到的反應溶液中加入生理鹽水使鎘-IgE螯合物 復溶；
[0012] (2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與IgE特 異性結合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0013] (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟⑴中樣品，然后上柱，IgE與 填料特異性結合；
[0014] (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0. lmol/L的磷 酸鹽溶液進行洗脫，得到洗脫液I ;
[0015] (5)收集：收集洗脫液I ;
[0016] (6)透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用ddH20透析除鹽，換水三次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0017] (7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鎘特異性結合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0018] (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（6)中樣本，然后上柱；
[0019] (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的磷 酸鹽溶液進行洗脫，得到洗脫液II ;
[0020] (10)收集：收集洗脫液II ;
[0021] (11)透析：將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用ddH20透析除鹽，換水三 次后，4°C透析過夜，收集樣本，即得鎘-IgE螯合物。
[0022] 其中，上述鎘-IgE螯合物的制備方法，還包括步驟C):對鎘-IgE螯合物的鑒定；
[0023] 其中，步驟C)中具體如下：
[0024] (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0025] (2)加樣：取步驟B)中提取純化得到的鎘-IgE螯合物，加入稀釋緩沖液，并混勻， 然后加樣于樣品槽中；
[0026] (3)電泳：連接電泳板，進行電泳；
[0027] (4)檢測：在膠床上找出含鎘的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測是否含有鎘以及檢測鎘的含量。
[0028] 本發(fā)明還提供一種如上述的鎘-IgE螯合物在制備檢測人體內(nèi)鎘-IgE螯合物的試 劑或試劑盒中的應用。
[0029] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鎘-IgE螯合物作為標準品的試劑盒。
[0030] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲IgE的物質(zhì)或捕獲鎘的物 質(zhì)。
[0031] 本發(fā)明還提供一種定量檢測鎘-IgE螯合物的方法，以已知含量的上述的鎘-IgE 螯合物作為標準品，采用以下方法之一對樣品進行檢測：酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收 光譜結合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結合法、提純鎘-IgE螯合物與酶聯(lián)免疫結 合法、提純鎘-IgE螯合物與原子吸收光譜結合法、提純鎘-IgE螯合物與電感耦合等離子體 質(zhì)譜結合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結合法。
[0032] 實施本發(fā)明的鎘-IgE螯合物及其制備方法和應用，具有以下有益效果：
[0033] 1.本發(fā)明首次體外合成鎘-IgE螯合物；
[0034] 2.本發(fā)明首次提出鎘-IgE螯合物可用于制備檢測血樣中鎘-IgE螯合物的試劑或 試劑盒中的應用。
[0035] 3.本發(fā)明建立了鎘-IgE螯合物的定性定量檢測方法，以便定量檢測鎘-IgE螯合 物在評價一個地區(qū)鎘污染程度的應用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中鎘-IgE螯合物 可以間接反映這個地區(qū)人群受鎘污染的情況，從而間接反映這個地區(qū)鎘污染程度。本發(fā)明 建立的鎘-IgE螯合物定量檢測方法其準確度大大提高，并且使檢測的重復性得到大大提 尚。
【附圖說明】
[0036] 圖1為本發(fā)明所述的鎘-IgE螯合物的非變性電泳條帶圖；
[0037] 圖2為本發(fā)明所述的鎘-IgE螯合物的電泳條帶的同步輻射X線熒光分析圖。
【具體實施方式】
[0038] 下面，結合【具體實施方式】，對本發(fā)明做進一步描述：
[0039] 本發(fā)明除特別說明外，涉及的實驗操作步驟均為本領域常規(guī)的步驟，所用試劑、材 料如下述所列舉，在本發(fā)明中沒有列舉出來的均為本領域常用的試劑或可以通過市購方式 獲得：
[0040] 磷酸鹽溶液為 0? 05-0. lmol/L Na2HP04溶液或 0? 5-lmol/L Na 2HP04溶液；
[0041] 提取試劑為PEG溶液、硼酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0042] 膠床介質(zhì)為瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種；
[0043] 捕獲IgE的物質(zhì)購買自艾美捷科技有限公司的型號為Abeam abl71396的兔 Anti-IgE抗體；其中，本發(fā)明所述與IgE特異性結合的物質(zhì)、抗IgE抗體、抗IgE抗體均為 捕獲IgE的物質(zhì)；
[0044] 捕獲鎘的物質(zhì)為巴傲得生物科技有限公司生產(chǎn)的型號為AP7015的抗鎘抗體；其 中，本發(fā)明所述與鎘特異性結合的物質(zhì)、Cd抗、抗Cd抗體、抗鎘抗體均為捕獲鎘的物質(zhì)；
[0045] 酶標抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標記的抗體中的一種；
[0046] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液；
[0047] 洗滌液為含有 KH2P040 . 2mg/ml、Na2HP04 ? 12H20 2. 90mg/ml、NaC18. Omg/ml、KC1 0? 2mg/ml、0. 5% Tween-20 的 pH 為 7. 4 的 0? 15M PBS 溶液；
[0048] 封閉液為1 % _5 %牛血清白蛋白或脫脂奶粉；
[0049] 稀釋緩沖液為含 1. 5mg/mL Na2C03、2. 93mg/ml NaHC03的 PH 為 9. 6 的 0? 05M 碳酸 鹽緩沖液；