一種降解菲的Terrimonas菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境修復(fù)和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于降解環(huán)境有機(jī)污染 物一一菲的菌株及其應(yīng)用，本發(fā)明還涉及一種降解菲的方法和一種用于降解土壤菲的微生 物菌劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 多環(huán)芳香烴化合物（PAHs)是一類由兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)以線性排列、彎接或者 簇聚等不同方式排列形成的有機(jī)化合物。根據(jù)PAHs分子量的大小，可以將多環(huán)芳烴分為低 分子量的PAHs(如萘、菲，芴等）和高分子量的PAHs(如熒蒽、芘、苯并芘等）。多環(huán)芳烴的 來源主要包括兩個(gè)方面：一方面是自然界自身的活動(dòng)，如森林火災(zāi)、動(dòng)植物遺體腐爛、石油 煤炭形成、火山噴發(fā)等；另外一個(gè)方面是人類污染行為，如化石燃料的不完全燃燒、城市固 體廢棄物的焚燒、石油開采、加工運(yùn)輸以及化工生產(chǎn)和汽車尾氣的排放等。人類活動(dòng)向環(huán)境 貢獻(xiàn)了絕大多數(shù)的多環(huán)芳烴污染，是公認(rèn)的環(huán)境多環(huán)芳烴主要污染來源。PAHs已經(jīng)廣泛存 在于空氣，水體和土壤及其河流湖泊的沉積物。隨著全球人口數(shù)量的不斷爆炸式增長以及 城市化、工業(yè)化的進(jìn)程的不斷加劇，人類生存環(huán)境中的多環(huán)芳烴污染的控制和修復(fù)已經(jīng)變 得刻不容緩。
[0003] 菲是一類環(huán)境持久性污染物，由于其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，菲具有低水溶性，高疏水性 和強(qiáng)化學(xué)穩(wěn)定性，在自然界中難以被生物體利用。同時(shí)，菲也是被廣泛證實(shí)的具有致癌、致 畸、致突變的"三致"效應(yīng)的污染物。由于其獨(dú)特的化學(xué)穩(wěn)定性和環(huán)境持久性，傳統(tǒng)的物理 化學(xué)處理方法（揮發(fā)、光解、化學(xué)氧化、電修復(fù)以及混凝絮凝等方法）不能將其完全去除，同 時(shí)處理成本高昂，容易產(chǎn)生二次污染。
[0004] 微生物修復(fù)的實(shí)質(zhì)是利用土壤微生物專一性代謝土壤中的有機(jī)污染物，將其 轉(zhuǎn)化為細(xì)胞其它碳基大分子和二氧化碳的過程。因此實(shí)施和建立一套土壤有機(jī)污染物 的微生物修復(fù)方法的核心是篩選代謝速度快，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的污染物降解菌。直接從 環(huán)境中富集篩選土著微生物，避免了基因工程菌在實(shí)際應(yīng)用中難以回避的生物安全的問 題，是一種簡(jiǎn)單方便理想的技術(shù)手段。同時(shí)從土壤中分離獲得的微生物還具有定植能力 強(qiáng)，環(huán)境適應(yīng)性廣等特點(diǎn)。目前人們已經(jīng)從各類生態(tài)環(huán)境中篩選獲得一批多環(huán)芳烴降解 菌，包括假單胞菌（Pseudomonas)、紅球菌（Rhodococcus)、分枝桿菌（Mycobacterium)、 芽孢桿菌（Bacillus)、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas)、氣單胞菌（Aeromonas)、拜葉 林克氏菌（Beijerinckia)、擬諾卡氏菌（Nocardioides)、解環(huán)菌（Cycloclasticus)、 伯克氏菌（Burkholderia)、叢毛單胞菌（Polaromonas)以及一些嗜熱厭氧的菌屬 如嗜油菌（Neptunomonas)、兩面神菌（Janibacter)、諾卡氏菌（Nocardia)、變性菌 (Deltaproteobacteria)和產(chǎn)喊菌（Alcaligenes)等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的用于降解菲的菌株。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述菌株在降解菲中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種降解菲的方法。
[0008] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種用于降解土壤菲的微生物菌劑。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)第一個(gè)目的，申請(qǐng)人從石油污染的土壤中分離獲得一株能夠快速降解菲的 菌株，通過生理生化鑒定和核糖體16SrDNA基因序列分析將其鑒定為Terrimonas屬。命 名為Terrimonassp.WP1，該菌株已于2015年5月11日送交位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi) 的中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)保藏，保藏編號(hào)為：CCTCCN0:M2015292。
[0010] 該菌株在pH在5-10范圍，鹽離子濃度為5%以下，及溫度在16-37°C范圍內(nèi)具有 對(duì)菲的高效降解能力，具有廣泛的環(huán)境適應(yīng)性。同時(shí)，該菌株在代謝菲的過程中不會(huì)產(chǎn)生羥 基化菲代謝中間產(chǎn)物的蓄積，不會(huì)造成環(huán)境的二次污染，是對(duì)土壤或環(huán)境菲污染物進(jìn)行生 物修復(fù)的優(yōu)秀微生物材料。
[0011] 同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種基于Terrimonassp.WP1菌株的菲降解方法和一種用 于降解土壤菲的微生物菌劑。
[0012] 更詳細(xì)的技術(shù)方案見《具體實(shí)施方案》所述。
【附圖說明】
[0013] 圖1是根據(jù)WP1菌株16SrRNA編碼基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。
[0014] 圖2是WP1菌株在200mg/L菲濃度下的生長和降解曲線圖，圖中三角符號(hào)數(shù)據(jù)代 表培養(yǎng)過程中殘留菲的濃度，正方形符號(hào)數(shù)據(jù)代表培養(yǎng)體系在〇D6。。吸光值。
[0015] 圖3是WP1菌株在不同pH條件下對(duì)菲的降解能力柱狀圖。
[0016] 圖4是WP1菌株在不同鈉離子濃度條件下對(duì)菲的降解能力柱狀圖。
[0017] 圖5是WP1菌株在不同溫度條件下對(duì)菲的降解能力柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說明。需要說明的是，本發(fā)明的實(shí)施例僅限 于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，而沒有限制作用。實(shí)施例中所涉及的有關(guān)篩選方法、緩沖液配制和常 見培養(yǎng)基配方等可參照趙斌，何紹江主編的《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》以及《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》所 描述的內(nèi)容（參見J.薩姆布魯克等，2002,分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等（譯），科 學(xué)出版社，北京）。本發(fā)明中所涉及的其他各種實(shí)驗(yàn)操作，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，文中沒有 特別說明的部分，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請(qǐng)日之前的各種常用工具書、 科技文獻(xiàn)或相關(guān)的說明書、手冊(cè)等予以實(shí)施。
[0019] 實(shí)施例1WP1菌株的分離鑒定
[0020] 采用來自長慶油田長期受石油污染的土壤為篩選土壤，具體篩選方案如下：
[0021] 1)取10g土壤，加入到含有200mg/L菲的無機(jī)鹽MSM中，28°C震蕩培養(yǎng)7天，再以 10%的接種量接到含有200mg/L菲的無機(jī)鹽MSM培養(yǎng)基中；連續(xù)轉(zhuǎn)接5次。
[0022] 2)取0. 1ml步驟1)所得到的富集培養(yǎng)液，涂布到含菲的MSM固體平板上，28°C靜 止培養(yǎng)5天后，將平板上長出來的菌落轉(zhuǎn)接到含菲的MSM固體平板上，繼續(xù)培養(yǎng)生長，直到 平板上出現(xiàn)單一的菌落。
[0023] 3)挑取含菲的MSM固體平板上生長出來的單菌落，接種到含有200mg/L菲的MSM 液體培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)5天，獲得本發(fā)明的菌株。
[0024] 進(jìn)一步對(duì)菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。
[0025] 首先，對(duì)菌株的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了初步的觀察，結(jié)果表明，該菌株為革蘭氏陰性 菌，桿狀；菌落為紅色。
[0026] 同時(shí)，發(fā)明人分離所獲菌株的基因組DNA，然后以細(xì)菌16SrRNA基因的通用引物 27F和1492R引物對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，其序列如序列表 SEQIDN0:1所示。然后，利用NCBI核酸數(shù)據(jù)庫，根據(jù)菌株16SrRNA基因序列進(jìn)行了BLAST 分析，結(jié)果表明菌株的16SrRNA基因序列與Terrimonas屬的StrainM-8菌株同源性高達(dá) 99%的相似性。同時(shí)，選取所有161'1'；[1]1〇118屬已經(jīng)報(bào)道的菌株的163 11?熟編碼序列，同屬于 泉發(fā)菌科（Crenotrichaceae)的菌株，以及部分相似的未確定分類地位的菌株的16SrRNA 編碼序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示，WP1菌株與所有Terrimonas屬菌株聚為一個(gè) 分支，且與其它菌株明顯屬于不同分子。因此，發(fā)明人根據(jù)上述分子鑒定結(jié)果，結(jié)合革蘭氏 染色和形態(tài)學(xué)觀察，將該菌株命名為Terrimonassp.WP1。
[0027] 實(shí)