正丙 醇：甲醇：氨水（25 :20 :23，v/v/v)，薄層板于37°C展開(kāi)5h。待溶劑揮發(fā)干后，將硅膠板貼 在鋪好鑒定菌的生物檢定盤上吸附l〇min。取下硅膠板，將檢定盤置于37°C培養(yǎng)16~18h。 發(fā)現(xiàn)工程菌卡那霉素B的產(chǎn)量明顯上升?；蚬こ叹擎溍咕鶻N126與出發(fā)菌株發(fā)酵液 的TLC色譜比較情況見(jiàn)圖3。
[0098] 3、發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化
[0099] 收集發(fā)酵液，等倍稀釋后加入0. 5% (w/v)研細(xì)的草酸，用10%H2SOJlpH至2. 0， 靜置2h。10000r/min離心lOmin，收集上清，用濃氨水調(diào)至9. 0,靜置過(guò)夜。10000r/min離 心lOmin，收集上清液，10%H2S04調(diào)至pH5. 5。
[0100] 以732樹(shù)脂（NH4+型）靜態(tài)吸附6h。將飽和樹(shù)脂裝柱，蒸餾水洗至無(wú)色。0. 6mol/ LNH4C1洗脫除雜，3%氨水洗脫，收集活性部分。
[0101] 4、HPLC-ELSD分析
[0102] 采用DikmaDiamonsilCls(4.6X200mm，5ym)色譜柱，使用 0.2mol/L三氟乙酸： 甲醇（95:5)作為流動(dòng)相，流速0. 8mL/min。檢測(cè)器采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，檢測(cè)器的霧化管 溫度40°C，漂移管溫度80°C，載氣壓力0? 35MPa。
[0103] HPLC-ELSD圖譜詳見(jiàn)圖4。
[0104] 5、質(zhì)譜分析
[0105] 收集液相色譜峰的流出液，用冷凍干燥的方法濃縮，質(zhì)譜測(cè)定分子量。質(zhì)譜圖詳見(jiàn) 圖5。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種經(jīng)基因工程構(gòu)建的卡那鏈霉菌（Streptomyces kanamyceticus XN126)，其特征 在于，所述卡那鏈霉菌的雙脫氧酶基因kanj失活或由kanj基因編碼的雙脫氧酶失活。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡那鏈霉菌，其特征在于，所述kanj基因選自： (1) 具有SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的序列； (2) 與⑴中的序列同源的序列； (3) 在嚴(yán)格條件下與（1)或（2)中的序列雜交且編碼雙脫氧酶的序列；和/或 (4) 核苷酸序列與（1)或（2)中的序列有85%以上的同一性且編碼雙脫氧酶的序列； 優(yōu)選地，所述kanj基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的卡那鏈霉菌，其特征在于，所述失活是通過(guò)選自基因敲 除、基因置換、基因沉默、RNA干擾和點(diǎn)突變中的一種或多種方式實(shí)現(xiàn)的。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的卡那鏈霉菌，其特征在于，所述卡那鏈霉菌為卡 那鏈霉菌 XN126 (Streptomyces kanamyceticus XN126)，其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 10860。5. -種構(gòu)建用于生產(chǎn)卡那霉素B及其衍生物的卡那鏈霉菌的方法，其特征在于，所述 方法包括：通過(guò)基因工程方法使卡那鏈霉菌中的kanj基因失活或由kanj基因編碼的雙脫 氧酶失活； 優(yōu)選地，所述失活是通過(guò)選自基因敲除、基因置換、基因沉默、RNA干擾和點(diǎn)突變中的一 種或多種方式實(shí)現(xiàn)的。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因工程方法為通過(guò)框架內(nèi)缺失來(lái) 阻斷卡那鏈霉菌中的kanj基因。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述框架內(nèi)缺失包括以下步驟： (1) 構(gòu)建kanj基因雙交換阻斷質(zhì)粒； (2) 使用步驟（1)中構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化卡那鏈霉菌，獲得轉(zhuǎn)化子； (3) 篩選步驟（2)中獲得的轉(zhuǎn)化子，獲得雙交換菌株。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)包括構(gòu)建含大腸桿菌中的復(fù) 制起始位點(diǎn)ori、接合轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)oriT、大腸桿菌中的抗性篩選標(biāo)記、鏈霉菌中的抗性篩 選標(biāo)記，kanj的上下游同源片段（核苷酸序列命名為SEQ ID N0:4)的kanj基因雙交換阻 斷質(zhì)粒； 優(yōu)選地，所述步驟（1)包括： (1-1)以卡那鏈霉菌基因組DNA為模板，分別以SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6為上游引 物，SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8為下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (1-2)連接步驟（1-1)中分別得到的擴(kuò)增片段，得到kanj上游SEQ ID NO: 2所示的核 苷酸序列和kanj下游SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列，然后上游序列用BamHI和EcoRI酶 切下游序列用EcoRI和HindIII酶切，一起與經(jīng)BamHI和HindIII酶切的pIJ2925連接，得 到帶有A kanj(包括kanj上游SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列和kanj下游SEQ ID NO: 3 所示的核苷酸序列）片段PIJ2925,命名為pDLJ201 ; (1-3)以質(zhì)粒PSET152為模版PCR擴(kuò)增Am抗性基因和oriT位點(diǎn)，將得到的擴(kuò)增片段連 接到用EcoRI和KpnI酶切的質(zhì)粒pIJ2925上，用T4連接酶連接環(huán)化；和 (1-4)用BamHI和HindIII酶切步驟（1-3)中得到的含Am抗性基因和oriT位點(diǎn)的 PIJ2925,然后與步驟（1-2)中得到的經(jīng)BamHI和HindIII酶切的pDLJ2925連接，獲得kanj 基因雙交換阻斷質(zhì)粒PDLJ202。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，步驟（2)中所述的轉(zhuǎn)化是以大腸桿菌 介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移方法； 優(yōu)選地，所述步驟（2)包括： (2-1)將步驟（1)得到的kanj基因雙交換阻斷質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選氯霉素、卡那霉 素和安普霉素三抗菌株，獲得用于基因阻斷的供體菌；和 (2-2)將步驟（2-1)得到的供體菌和經(jīng)熱激與預(yù)培養(yǎng)的卡那鏈霉菌單孢子懸液混合培 養(yǎng)，在安普霉素和萘啶酮酸存在下培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)化子。10. 根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟（3)中所述的篩選包 括： 通過(guò)PCR擴(kuò)增、測(cè)序或Southern雜交的方式，比較步驟（2)得到的轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株 的基因組DNA，篩選目標(biāo)雙交換菌株；或者， 比較步驟（2)得到的轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株的雙脫氧酶的活性，篩選目標(biāo)雙交換菌株； 優(yōu)選地，所述步驟（3)包括： (3-1)將步驟（2)得到的轉(zhuǎn)化子分別在存在和不存在安普霉素的情況下培養(yǎng)，篩選出 安普霉素敏感的轉(zhuǎn)化子；和 (3-2)分別以步驟（3-2)得到的安普霉素敏感菌株和出發(fā)菌株基因組DNA為模板，以 SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8為上下游引物，比較擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小，從而由所述安普霉 素敏感菌株中篩選出目標(biāo)雙交換菌株。11. 一種包含SEQ ID N0:4或同時(shí)包含SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示核苷酸序列 的核酸分子。12. -種包含權(quán)利要求11所述的核酸分子的質(zhì)粒； 優(yōu)選地，所述質(zhì)粒為kanj基因雙交換阻斷質(zhì)粒pDLJ202。13. -種含有權(quán)利要求12所述的質(zhì)粒的宿主菌； 優(yōu)選地，所述宿主菌為大腸桿菌。14. 權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的卡那鏈霉菌在產(chǎn)生卡那霉素B及其衍生物中的用 途。15. 權(quán)利要求11所述的核酸分子、權(quán)利要求12所述的質(zhì)?；驒?quán)利要求13所述的宿主 菌在通過(guò)基因工程方法使卡那鏈霉菌的雙脫氧酶基因kanj失活或由kanj基因編碼的雙脫 氧酶失活中的用途； 優(yōu)選地，所述失活是通過(guò)選自基因敲除、基因置換、基因沉默、RNA干擾和點(diǎn)突變中的一 種或多種方式實(shí)現(xiàn)的； 優(yōu)選地，所述基因工程方法為通過(guò)框架內(nèi)缺失來(lái)阻斷卡那鏈霉菌中的kanj基因。16. -種生產(chǎn)卡那霉素B或其衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利 要求1至4中任一項(xiàng)所述的卡那鏈霉菌或者通過(guò)權(quán)利要求5至10中任一項(xiàng)所述的方法得 到的卡那鏈霉菌，分離純化發(fā)酵產(chǎn)物。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述衍生物為地貝卡星、阿貝卡星或其 前體藥物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種直接產(chǎn)生卡那霉素B的工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明提供的一種產(chǎn)生卡那霉素B的工程菌，其被命名為<i>Streptomyces</i><i>？kanamyceticus</i>？XN126，其保藏編號(hào)為CGMCC？No.10860。本發(fā)明革命性的降低了卡那霉素B的生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，提高了生產(chǎn)效率，并且在兼顧了節(jié)能減排和安全高效的同時(shí)，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和環(huán)境效益。CGMCC No.1086020150525
【IPC分類】C12N1/21, C12R1/465, C12N15/11, C12N15/76, C12P19/50
【公開(kāi)號(hào)】CN105039232
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510351145
【發(fā)明人】夏煥章, 高文麗, 倪現(xiàn)樸
【申請(qǐng)人】沈陽(yáng)藥科大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年6月23日