中進(jìn)行消化反應(yīng)，待細(xì)胞變圓后除去消化液，并加入胎牛血清以終止消化反應(yīng)；
D、將完成消化反應(yīng)的SD大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管中，在轉(zhuǎn)速為1500rpm的離心機(jī)中離心3min，除去上清液后，將沉淀加入到DMHM培基中培養(yǎng)即可。
[0022]步驟2)所述消化的溫度為37°C、時(shí)間20min。
[0023]步驟C中所述的消化液是將質(zhì)量濃度為0.125%的胰酶和質(zhì)量濃度為0.02%的EDTA按6:1的體積比混合并攪拌均勻后制得。
[0024]試驗(yàn)I
一種SD大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，包括了以下步驟:
I)無(wú)菌條件下取體重為100-150g的SD大鼠的頸總動(dòng)脈，并用PBS緩沖液洗去血污。
[0025]2)將頸總動(dòng)脈切成3-5cm的長(zhǎng)段，放入盛有2ml PBS溶液的培養(yǎng)皿中剝離外膜。
[0026]3)另取一培養(yǎng)皿，加入Iml質(zhì)量濃度為0.2 % I型膠原酶和Iml質(zhì)量濃度為
0.125%胰酶(兩種酶體積比為1:1)。將動(dòng)脈縱行剪開，使內(nèi)膜朝下平攤于培養(yǎng)皿上，使內(nèi)膜與酶充分接觸，37 °C消化20min。消化過(guò)程中輕輕拍打培養(yǎng)皿底部，使內(nèi)皮細(xì)胞脫落。
[0027]4)消化完后，將頸總動(dòng)脈移開，收集消化液，立即加入l_2ml胎牛血清終止消化。
[0028]5)將收集液離心(1500轉(zhuǎn)/分)3分鐘。
[0029]6)倒去上清，加入1-2 ml內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(M199培養(yǎng)基含10%體積濃度的胎牛血清，L-谷氨酰胺及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，北京塞默飛世爾生物公司生產(chǎn))用移液器吹散細(xì)胞，將所有液體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，于CO2培養(yǎng)箱(CO2濃度為5%)中，37°C培養(yǎng)。
[0030]所述SD大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的傳代方法，包括了以下步驟:
I)將步驟5離心得到的內(nèi)皮細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)24小時(shí)后，倒掉培養(yǎng)基，并用無(wú)菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉紅細(xì)胞和死細(xì)胞，加入2-4ml內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0031]2)以后每2-3天換一次培養(yǎng)基，一般培養(yǎng)4-6天，細(xì)胞可長(zhǎng)滿至80_90%單層，正常的內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)滿后如同卵石狀，此時(shí)可以傳代。
[0032]3)倒掉培養(yǎng)基，用無(wú)菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2_3ml消化液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為
0.125%胰酶和0.02% EDTA，按6:1比例混合)常溫消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，一旦細(xì)胞變圓，棄去消化液，即加入l_2ml胎牛血清終止反應(yīng)。
[0033]4)用移液器將細(xì)胞吹打下來(lái)，并將所消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)15ml無(wú)菌離心管中，1500轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘
5)倒掉上清，加入2-4ml內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，輕輕吹打，重懸細(xì)胞，均勻接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，即得到傳代細(xì)胞。選擇傳至2-3代的內(nèi)皮細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
[0034]試驗(yàn)2
I)購(gòu)買SD大鼠，飼養(yǎng)4-6周，至大鼠成年。無(wú)菌條件下取100-150 g SD大鼠頸總動(dòng)脈，并用PBS緩沖液洗去血污。將頸總動(dòng)脈切成3-5 cm的長(zhǎng)段，放入盛有2ml PBS溶液的培養(yǎng)皿中剝離外膜。另取一培養(yǎng)皿，加入Iml 0.2 % I型膠原酶和Iml 0.125%胰酶混勻。將頸總動(dòng)脈縱行剪開，使內(nèi)膜朝下平攤于培養(yǎng)皿上，使內(nèi)膜與酶充分接觸，37°C消化20min。消化過(guò)程中輕輕拍打培養(yǎng)皿底部，使內(nèi)皮細(xì)胞脫落。消化完后，將動(dòng)脈移開，收集消化液，立即加入2-4ml胎牛血清終止消化。將收集液離心(1500轉(zhuǎn)/分)3分鐘。倒去上清，加入l-2ml的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(M199培養(yǎng)基含10%體積濃度的胎牛血清，L-谷氨酰胺及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，北京塞默飛世爾生物公司生產(chǎn))，用移液器吹散細(xì)胞，將所有液體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，于CO2培養(yǎng)箱(CO2濃度為5%)中，370C培養(yǎng)。內(nèi)皮細(xì)胞在CO 2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)24小時(shí)后，倒掉培養(yǎng)基，并用無(wú)菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉紅細(xì)胞和死細(xì)胞，加入2-4ml內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。以后每2-3天換一次培養(yǎng)基，一般培養(yǎng)4-6天，細(xì)胞可長(zhǎng)滿至80-90%單層，正常的內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)滿后如同卵石狀，此時(shí)可以傳代。
[0035]2)原代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)24小時(shí)后，倒掉培養(yǎng)基，并用無(wú)菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉紅細(xì)胞和死細(xì)胞，加入2-4ml內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。以后每2_3天換一次培養(yǎng)基，一般培養(yǎng)4-6天，細(xì)胞可長(zhǎng)滿至80-90 %單層，正常的內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)滿后如同卵石狀，此時(shí)可以傳代。
[0036]3 )待傳代的細(xì)胞倒掉培養(yǎng)基，用無(wú)菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2_3ml消化液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.125%胰酶和0.02% EDTA，按6:1混合)常溫消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，一旦細(xì)胞變圓，棄去消化液，即加入l_2ml胎牛血清終止反應(yīng)。用移液器將細(xì)胞吹打下來(lái)，并將所消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)15ml無(wú)菌離心管中，1500轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘。倒掉上清，加入2-4ml內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，即得到傳代細(xì)胞。
[0037]試驗(yàn)3 a)將傳至第3代的內(nèi)皮細(xì)胞接種于96孔板中，密度15/孔。每孔中加入10ulM199培養(yǎng)基，正常培養(yǎng)12h后，換成無(wú)血清的M199培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h，使細(xì)胞同步化。棄去培養(yǎng)基，加入不同濃度的丹參注射液保護(hù)12h后，換成含120ug/ml Οχ-LDL的無(wú)血清M199培養(yǎng)基，每孔10ul，并設(shè)置正常對(duì)照組，每組三個(gè)平行復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集上清，三孔富集于一管中。每孔加入無(wú)血清培養(yǎng)基，并加入1uIMTT用酶標(biāo)儀在490nm處測(cè)定吸光值(0D490)。以對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，并設(shè)置DMSO空白組，其余各組細(xì)胞活力按下式計(jì)算:細(xì)胞活力(％)=(處理組0D490-空白組0D490)/ (對(duì)照組0D490-空白組0D490) X 100%
b)結(jié)果
人源氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)具有一定的細(xì)胞毒性，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有一定的損傷。Ox-LDL脂質(zhì)過(guò)氧化物能使動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞壞死，并增強(qiáng)脂質(zhì)蛋白對(duì)細(xì)胞壁的通透性。因此采用Ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而探究丹參對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，處理組Ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞，使細(xì)胞活力顯著下降；丹參給藥組與處理組相比活力顯著提高，并呈現(xiàn)濃度依賴，當(dāng)?shù)⒆⑸湟簼舛葹镮uM時(shí)，細(xì)胞活力最強(qiáng)，說(shuō)明丹參對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞存在明顯的保護(hù)作用。
[0038]試驗(yàn)4
I)將傳至第3代的內(nèi)皮細(xì)胞接種于96孔板中，密度15/孔。隨機(jī)分為5個(gè)組:(I)正常對(duì)照組:正常細(xì)胞培養(yǎng)；(2)模型組:魚腥草素鈉對(duì)脂多糖(15 μ g/ml, 12h) ; (3)阿司匹林(4 mM)組；(4)魚腥草素鈉(I mM)組；(5)魚腥草素鈉(0.1mM)組。阿司匹林組及魚腥草素鈉分別干預(yù)保護(hù)Ih后，再加入LPS作用12h復(fù)制內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷模型。每組設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔。
[0039]2 )分組處理后，收集培養(yǎng)液上清液，2000r/min離心20分鐘，收集上清液于-20°C冰箱冷凍保存待測(cè)。參照NO、eNOS、iNOS酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書測(cè)定培養(yǎng)上清液中各指標(biāo)成分含量。
[0040]3)血管的內(nèi)表面由一層內(nèi)皮細(xì)胞所覆蓋，炎性反應(yīng)主要集中發(fā)生在血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞襯覆于血管內(nèi)壁，是構(gòu)成血管通透性的主要屏障，并能合成和分泌調(diào)節(jié)凝血纖溶系統(tǒng)的物質(zhì)、調(diào)節(jié)血管張力的因子以及細(xì)胞因子等，在血管張力、血管形成及炎癥反應(yīng)中起有重要作用。本實(shí)驗(yàn)表明，魚腥草素鈉干預(yù)給藥后可明顯提高內(nèi)皮細(xì)胞存活率，降低乳酸脫氫酶外漏，并可增加內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液eNOS含量，及NO的分泌與釋放，提示魚腥草素鈉能夠改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的舒張功能，對(duì)心血管系統(tǒng)存在潛在的保護(hù)作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種SD大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)選取重為100-150g的SD大鼠，在無(wú)菌條件下切取SD大鼠的頸總動(dòng)脈并除去血污，備用; 2)將頸總動(dòng)脈切割成長(zhǎng)為3-5cm的長(zhǎng)段后放入PBS溶液中，剝除頸總動(dòng)脈的外膜，并將頸總動(dòng)脈沿縱向切割，把頸總動(dòng)脈的內(nèi)膜向下平攤于裝有消化酶溶液的容器內(nèi)，使頸總動(dòng)脈的內(nèi)膜與容器中的消化酶溶液充分接觸，實(shí)現(xiàn)頸總動(dòng)脈內(nèi)膜的消化，所述消化酶溶液由質(zhì)量濃度為0.2%的I型膠原酶和質(zhì)量濃度為0.125%的胰酶按1:1的體積比混合并攪拌均勾后制得； 3)在頸總動(dòng)脈內(nèi)膜消化的過(guò)程中振動(dòng)容器，使內(nèi)皮細(xì)胞脫落，消化結(jié)束后除去頸總動(dòng)脈，向容器中加入胎牛血清，且胎牛血清與容器中液體的體積比為1-2:2，攪拌均勻后制得混合液； 4)將混合液放入轉(zhuǎn)速為1500r/min的離心機(jī)中離心3min，除去上清液后得到頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，將頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞放入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)期后轉(zhuǎn)入溫度為37°C、CO2體積濃度為5%的CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，之后進(jìn)行傳代培養(yǎng)即可。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種SD大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟2)所述消化的溫度為37°C、時(shí)間20min。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種SD大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于:所述SD大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的傳代方法，包括了以下步驟: A、把步驟4離心得到的SD大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞放入溫度為37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，然后倒掉培養(yǎng)基，并用無(wú)菌PBS溶液中清洗2-3次，以除去紅細(xì)胞和死細(xì)胞； B、將步驟A處理后的SD大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)入EBM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔2-3天換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)4-6天后除去培養(yǎng)基，并用無(wú)菌PBS溶液清洗，備用； C、將SD大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)入消化液中進(jìn)行消化反應(yīng)，待細(xì)胞變圓后除去消化液，并加入胎牛血清以終止消化反應(yīng)； D、將完成消化反應(yīng)的SD大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管中，在轉(zhuǎn)速為1500rpm的離心機(jī)中離心3min，除去上清液后，將沉淀加入到DMHM培基中培養(yǎng)即可。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種SD大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟C中所述的消化液是將質(zhì)量濃度為0.125%的胰酶和質(zhì)量濃度為0.02%的EDTA按6:1的體積比混合并攪拌均勻后制得。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種SD大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，包括以下步驟：1）在無(wú)菌條件下切取SD大鼠的頸總動(dòng)脈；2）將頸總動(dòng)脈切割成段后放入PBS溶液中，剝除外膜，并將頸總動(dòng)脈沿縱向切割，把內(nèi)膜向下平攤于裝有消化酶溶液的容器內(nèi)，使頸總動(dòng)脈的內(nèi)膜與容器中的消化酶溶液充分接觸；3）振動(dòng)容器，使內(nèi)皮細(xì)胞脫落，消化結(jié)束后除去頸總動(dòng)脈，向容器中加入胎牛血清，攪拌均勻后制得混合液；4）將混合液離心，除去上清液后得到頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，將頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞放入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)期后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，之后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。本發(fā)明不僅成活率高、對(duì)細(xì)胞損害低，且經(jīng)濟(jì)實(shí)用、簡(jiǎn)單易行，適于工廠等大規(guī)模生產(chǎn)。
【IPC分類】C12N5/071
【公開號(hào)】CN105039240
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510432670
【發(fā)明人】王燕華, 武福華, 王小立, 王保平, 郭昭涵, 張乃群
【申請(qǐng)人】南陽(yáng)師范學(xué)院
【公開日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年7月22日