[0040]其中，實施例1-3采用以下步驟檢測和驗證視黃酸對原始生殖細胞增殖的促進作用。
[0041]UBrdU (溴脫氧核苷尿嘧啶)染色
小鼠原始生殖細胞與飼養(yǎng)層細胞共同用0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化成單細胞，用10% FBS終止消化；離心，棄上清，用4%多聚甲醛室溫固定細胞15 min ;載玻片事先用APES處理，處理方法如下:APES用丙酮1:50稀釋，清洗好的載玻片泡在無水乙醇中，處理之前用干凈的紗布擦干凈，載玻片依次放入APES、丙酮I和丙酮II的染缸中，三個步驟都是45秒鐘，拿出片子自然晾干后即可使用；固定后的細胞滴到處理好的載玻片上，熱臺38°C烘干；片子放入PSB中洗3遍；將片子放入PBST (含有0.5% Triton X-100的PBS)中透化10 min ;透化完成后，將片子放入2N HCl中處理20 min, PBS洗一遍；吸干片子表面的液體，在載玻片正面滴加50 μι含10%山羊血清的PBST，樣品區(qū)蓋加封口膜，放在濕盒中，室溫封閉45 min;用吸水紙吸去片子上多余的封閉液，用封閉液稀釋一抗(BrdU，鼠抗，1:200稀釋)，每張片子加20 μ I 一抗稀釋液于細胞的位置，用封口膜蓋住樣品區(qū)域；片子放到濕盒中密封后放在4°C孵育過夜；一抗孵育結(jié)束后，用鑷子輕輕揭掉封口膜，放在含有1%BSA的PBS中洗三遍；在暗室中將片子上的PBS吸干凈，用含有1% BSA的PBS稀釋二抗(Cy3標記的山羊抗小鼠)，每張片子滴加20 μ I 二抗稀釋液，在細胞區(qū)域蓋加封口膜；在濕盒中用封口袋封住，37°C孵育I小時；揭掉封口膜，放到PBS中洗3遍；吸干PBS，每張片子加20μ I Hoechst 33342，蓋上封口膜室溫孵育10 min ;揭掉封口膜，把片子放在PBS中涮3遍，每遍大約I秒鐘。吸干載玻片表面的液體，滴加半滴Vectashield，滴在組織切片邊上，蓋玻片蓋住片子；做好的切片置于干盒中，套上封口袋，4 °C保存；用激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。
[0042]2、細胞免疫熒光
小鼠原始生殖細胞與飼養(yǎng)層細胞共同用0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化成單細胞離心，棄上清，多聚甲醛室溫固定細胞；細胞滴到處理好的載玻片上，熱臺38°C烘干；用PSB洗 3 遍，PBST (含有 0.5% Triton X-100 的 PBS)透化 10 min ;PBS 洗一遍；加 50 μ? 含10%山羊血清的PBST，在樣品區(qū)蓋加封口膜，室溫封閉45 min ;棄去多余的封閉液，用封閉液稀釋一抗(SSEA-1，鼠抗，1:80稀釋)，每張片子加20 μ I—抗稀釋液并蓋上封口膜；片子放到濕盒中用封口袋密封后放在4°C孵育過夜；一抗孵育結(jié)束后，用含1% BSA的PBS洗三遍；在暗室中每張片子滴加20 μ I 二抗稀釋液(cy3標記的山羊抗小鼠)，37°C孵育I小時；PBS中洗3遍；每張片子加20 μ I Hoechst 33342，蓋上封口膜室溫孵育10 min ;揭掉封口膜，PBS洗3遍，每遍大約I秒鐘；滴加半滴Vectashield在片子，蓋玻片蓋住片子，4 °C保存在干盒中待觀察。
[0043]3、流式細胞儀分析細胞周期
小鼠原始生殖細胞與飼養(yǎng)層細胞共同用0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化成單細胞離心，棄上清，加入I ml預(yù)冷的PBS洗一遍，離心，棄上清，用預(yù)冷的70%乙醇4°C固定細胞一小時。離心棄掉固定液，加I ml PBS清洗，離心，棄上清，每個樣加50 μ I PI稀釋液(PBS:P1:RNaseA=100:5:1)，避光，37°C孵育 30 min。孵育完成后，加入 I ml PBS 混勻，300目細胞篩過濾，轉(zhuǎn)移到流式管中上機。
[0044]4、流式統(tǒng)計小鼠原始生殖細胞SSEA-1的陽性細胞
小鼠原始生殖細胞與飼養(yǎng)層細胞共同用0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化成單細胞離心，棄上清，PBS清洗，離心，多聚甲醛室溫固定30 min ;離心，棄上清，加入I ml PBS清洗，離心；加入I ml PBST (含0.05% Triton X-100的PBS)透化5 min，離心，棄上清后加Iml PBS洗一遍，離心，棄上清，加入含10%山羊血清或馬血清的PBST，室溫封閉一小時；離心，棄封閉液，加入30 μ I SSEA-1—抗(1:80稀釋)，4°C孵育過夜；用含有I % BSA的PBS洗I遍，離心；在暗室中棄上清后加入二抗(FITC標記的山羊抗小鼠，1:50稀釋)，37°C避光放置I小時；用PBS洗一遍后加入4%多聚甲醛，300目細胞篩過濾，上機。
【主權(quán)項】
1.一種促進小鼠皮膚干細胞分化的原始生殖細胞增殖的方法，包括以下操作步驟:第一步，小鼠皮膚干細胞的分離培養(yǎng)；第二步，小鼠皮膚干細胞體外形成擬胚體結(jié)構(gòu)；第三步，小鼠胚胎成纖維細胞的培養(yǎng)及飼養(yǎng)層細胞的制備；第四步，擬胚體細胞與飼養(yǎng)層細胞共培養(yǎng)向原始生殖細胞分化；其特征在于，在第四步中還加入視黃酸來促進原始生殖細胞的增殖。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進小鼠皮膚干細胞分化的原始生殖細胞增殖的方法，其特征在于，加入的視黃酸的濃度為2 ymol/L~10 ymol/L03.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種促進小鼠皮膚干細胞分化的原始生殖細胞增殖的方法，其特征在于，所述的小鼠皮膚干細胞的分離培養(yǎng)包含以下步驟:通過收集出生當天小鼠，取背部皮膚，將皮膚組織剪成1-2_2的碎片，消化后棄掉消化液，使用40 μ m細胞濾器過濾細胞，收集單細胞，加皮膚干細胞培養(yǎng)液重懸細胞，將細胞過150目細胞篩。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種促進小鼠皮膚干細胞分化的原始生殖細胞增殖的方法，其特征在于，所述的小鼠皮膚干細胞體外形成擬胚體結(jié)構(gòu)包含以下步驟:將第一步所得的小鼠皮膚干細胞培養(yǎng)到第二代又3-4天時，將細胞收集到離心管中，離心，棄上清液，加入擬胚體分化培養(yǎng)液，吹打成單細胞，分散到24孔板中培養(yǎng)，每兩天換半液，用槍將其吹散，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)，I天后懸浮細胞會聚集形成擬胚體結(jié)構(gòu)，4天時擬胚體結(jié)構(gòu)變得致密，并且體積增大。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種促進小鼠皮膚干細胞分化的原始生殖細胞增殖的方法，其特征在于，所述的小鼠胚胎成纖維細胞的培養(yǎng)及飼養(yǎng)層細胞的制備包含以下步驟:取出子宮中的胎鼠，只保留軀干部分，用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化，消化后用移液槍吹打，離心，加培養(yǎng)液重懸細胞，400目細胞篩過濾，把細胞接種到成纖維細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)，作PO代，傳代時收集細胞懸液，離心，接入成纖維細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，選P2-P4代生長在對數(shù)期的胚胎成纖維細胞，加入含有絲裂霉素C的成纖維細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中孵育，孵育完后用磷酸緩沖液洗5遍，用0.25%胰蛋白酶將貼壁的成纖維細胞消化下來，收集細胞，重懸細胞后，轉(zhuǎn)入24孔貼壁培養(yǎng)板，每孔接種6-8 X 14個成纖維細胞，幾乎全部細胞貼壁后可用來做飼養(yǎng)層細胞。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種促進小鼠皮膚干細胞分化的原始生殖細胞增殖的方法，其特征在于，所述的擬胚體細胞與飼養(yǎng)層細胞共培養(yǎng)向原始生殖細胞分化過程包含以下步驟:將第二步培養(yǎng)的擬胚體消化成單細胞，加入少量原始生殖細胞培養(yǎng)液懸浮細胞，將細胞稀釋為15個cells/ml，然后接種到飼養(yǎng)層細胞所在的24孔板中，用原始生殖細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，兩天后，待到幾乎全部的細胞貼壁生長，在不破壞培養(yǎng)皿底部細胞的基礎(chǔ)上，用移液槍吸走全部培養(yǎng)液，加入500 μ I新的視黃酸的原始生殖細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，此后每兩天換半液，即吸出200 μ I培養(yǎng)液，加入250 μ I預(yù)暖的新鮮原始生殖細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第4天之后，原始生殖細胞開始大量出現(xiàn)。
【專利摘要】本發(fā)明是一種促進小鼠皮膚來源干細胞分化的原始生殖細胞增殖的方法，包括以下操作步驟：第一步，小鼠皮膚干細胞的分離培養(yǎng)；第二步，小鼠皮膚干細胞體外形成擬胚體結(jié)構(gòu)；第三步，小鼠胚胎成纖維細胞的培養(yǎng)及飼養(yǎng)層細胞的制備；第四步，擬胚體細胞與飼養(yǎng)層細胞共培養(yǎng)向原始生殖細胞分化；其中，在第四步中加入視黃酸來促進原始生殖細胞的增殖。視黃酸能夠促進皮膚干細胞來源的原始生殖細胞以及體內(nèi)來源的原始生殖細胞的體外增殖，達到了從有限的材料來源獲得大量的原始細胞樣細胞的目的，操作簡便，可重復(fù)性好。
【IPC分類】C12N5/075
【公開號】CN105039246
【申請?zhí)枴緾N201510534037
【發(fā)明人】李蘭, 譚慧, 程順峰, 孫曉鳳, 沈偉
【申請人】青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年8月27日