復(fù)制缺陷型黃病毒疫苗和疫苗載體的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是國際申請日為2009年3月16日、國際申請?zhí)枮镻CT/US2009/001666、進 入國家階段的申請?zhí)枮?00980116782. 2、發(fā)明名稱為"復(fù)制缺陷型黃病毒疫苗和疫苗載體" 的PCT申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及復(fù)制缺陷型黃病毒疫苗和疫苗載體，和對應(yīng)的組合物和方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 黃病毒分布于全世界，且代表一個全球性公共衛(wèi)生問題。黃病毒作為獸醫(yī)病原體 也具有重要影響。黃病毒病原體包括黃熱?。╕F)、登革熱型l-4(DENl-4)、日本腦炎（JE)、 西尼羅河（WN)、蜱傳腦炎（TBE)和來自TBE血清復(fù)合物的其它病毒，例如基亞薩努森林病 (KFD)和鄂木斯克出血熱（0HF)病毒?？傻玫娇筜F[減毒活疫苗（LAV)菌株17D]、JE[滅活疫 苗（INV)和LAV]和TBE(INV)的疫苗。目前不可得到許可的抗DEN和WN的人疫苗。獸醫(yī)疫 苗已經(jīng)在使用，包括，例如，在亞洲分別用于預(yù)防馬的腦炎和豬的死產(chǎn)的抗馬的WN(INV，重 組的和活的嵌合疫苗）、JE(INV和LAV)的疫苗，在英國用于預(yù)防綿羊的神經(jīng)學(xué)疾病的抗羊 跳躍病黃病毒的疫苗（INV)，和在捷克共和國用于耕種動物的抗TBE的疫苗（INV)(Monath 和Heinz，F(xiàn)laviviruses，見Fields等人編，F(xiàn)ieldsVirology，第 3 版，Philadelphia，New York，Lippincott-RavenPublishers，1996,961-1034 頁）〇
[0004] 蜱傳腦炎（TBE)是人類的最重要的蜱傳播的病毒病。它是歐洲和北亞的部分地 方的地方病，每年造成超過10, 〇〇〇人住院治療，在歐洲的病死率是〇. 5-1. 5%，在西伯利亞 和遠東是6-40%。高比例的患者遭受長期的神經(jīng)精神病學(xué)后遺癥。已經(jīng)證實，在雞胚細 胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)的滅活疫苗可以有效地預(yù)防該病。例如，覆蓋奧地利人口的86% (在歐洲 國家中最高）的疫苗接種，已經(jīng)導(dǎo)致住院病例減少了約90% (Heinz和Kunz，Arch.Virol. Suppl. 18 :201-205,2004)。滅活疫苗是昂貴的，且初次免疫需要接種3次。需要周期性加 強（每隔2-5年）來維持免疫。因此，需要花費更低的TBE疫苗，其在1-2次給藥后是有效 的，且提供持久的、例如終身的免疫（類似于用YF17D免疫接種實現(xiàn)的免疫），實際上已經(jīng) 被WHO鑒定為特別優(yōu)選。在過去的幾個世紀，借助于TBE病毒親本本身的經(jīng)驗的或理性的 減毒，或TBE或蘭加特（LGT，與TBE密切相關(guān)（血清學(xué)地）的天然減毒的黃病毒）病毒與登 革熱4病毒的嵌合，對TBELAV候選物的開發(fā)，已經(jīng)面臨困難，這是由于候選物的殘余毒力 和/或低免疫原性/過度減毒的問題（Wright等人，Vaccine26 :882_890, 2008;Maximova 等人，J.Virol. 82 :5255_5268,2008;Rumyantsev等人，Vaccine24 :133_143,2006;Kofler 等人，Arch.Virol.Suppl. 18 :191-200, 2004 ;和其中的參考文獻）。
[0005] 黃病毒是小的、有被膜的、正鏈RNA病毒，主要通過節(jié)肢動物媒介（蚊子或蜱）傳 遞到天然宿主，后者主要是脊椎動物，例如各種哺乳動物，包括人類和禽類。黃病毒基因組 RNA分子的長度是約11，000個核苷酸（nt)，且包括長開放讀碼框（0RF)，后者側(cè)接長度分別 為約120和500個核苷酸的5'和3'不翻譯末端區(qū)域（UTR)。所述0RF編碼多蛋白前體， 后者在翻譯同時和翻譯后被切割，產(chǎn)生單個病毒蛋白。以下述次序編碼蛋白：C-prM/M-E-NS1-NS2A/2B-NS3-NS4A/4B-NS5,其中C(核心/衣殼）、prM/M(膜前/膜）和E(被膜）是結(jié) 構(gòu)蛋白，即病毒顆粒的組分，而NS蛋白是非結(jié)構(gòu)蛋白，其參與細胞內(nèi)病毒復(fù)制。黃病毒復(fù)制 發(fā)生在胞質(zhì)中。在感染細胞并翻譯基因組RNA后，多蛋白的加工從多蛋白的prM部分易位 進受感染的細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER)內(nèi)腔開始，隨后是E和NS1部分的易位，這由prM、E和NS1 蛋白的疏水信號指導(dǎo)。prM、E和NS1蛋白的氨基末端由細胞信號肽酶切割產(chǎn)生，該酶位于 ER膜的腔側(cè)上，得到的單個蛋白保持羧基末端錨定在膜中。非結(jié)構(gòu)區(qū)中的大部分剩余切割 由病毒的NS2B/NS3絲氨酸蛋白酶來完成。該病毒蛋白酶也負責(zé)產(chǎn)生在后代病毒體中發(fā)現(xiàn) 的成熟C蛋白的C-末端。新合成的基因組RNA分子和C蛋白形成致密的球形核衣殼，后者 被其中嵌入E和prM蛋白的細胞膜包圍。通過切割prM生成成熟的M蛋白，之后不久由細 胞的弗林蛋白酶或類似的蛋白酶釋放出病毒。E(被膜的主要蛋白）是中和抗體的主要靶 物，是抗黃病毒感染的免疫的主要關(guān)聯(lián)物。病毒特異性的細胞毒性的T-淋巴細胞（CTL)應(yīng) 答是免疫的其它關(guān)鍵特質(zhì)。已經(jīng)在不同的黃病毒結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白中表征出多種CD8+和 CD4+CTL表位。另外，先天的免疫應(yīng)答有助于病毒清除和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答和免疫記憶的 發(fā)展。
[0006] 除了上面討論的抗黃病毒的滅活的（INV)和減毒活的（LAV)疫苗以外，已經(jīng)開發(fā) 出其它疫苗平臺。一個實例是基于嵌合的黃病毒，其包括黃熱病病毒衣殼和非結(jié)構(gòu)序列和 來自尋求免疫的其它黃病毒的prM-E蛋白。該技術(shù)已經(jīng)用于開發(fā)抗登革熱（DEN)、日本腦 炎（JE)、西尼羅河（WN)和圣路易腦炎（SLE)病毒的疫苗候選物（參見，例如，美國專利號 6, 962, 708和6, 696, 281)?；邳S熱病病毒的嵌合黃病毒已經(jīng)在臨床試驗中產(chǎn)生了非常有 前景的結(jié)果。
[0007] 另一種黃病毒疫苗平臺是基于假感染病毒（PIV)技術(shù)的應(yīng)用（Mason等人， Virology351 :432-443, 2006;Shustov等人，J.Virol. 21 :11737-11748, 2007;Widman等 人，Adv.Virus.Res. 72 :77-126, 2008;Suzuki等人，J.Virol. 82 :6942-6951，2008;Suzuki 等人，J.Virol. 83 :1870-1880,2009;Ishikawa等人，Vaccine26 :2772-2781，2008;Widman 等人，Vaccine26:2762-2771，2008)。PIV是通過刪除減毒的復(fù)制缺陷型病毒。不同于活 的黃病毒疫苗，它們在體內(nèi)經(jīng)歷單輪復(fù)制（或任選地有限輪數(shù)，對于雙組分構(gòu)建體；參見下 文），其可以提供安全性方面的益處。PIV也不誘導(dǎo)病毒血癥和全身感染。此外，不同于滅 活的疫苗，PIV會模仿完整病毒感染，由于有力的B-和T-細胞應(yīng)答的誘導(dǎo)，這可以導(dǎo)致增加 的功效、更高的免疫持久性和降低的劑量需求。類似于完整病毒，PIV疫苗靶向抗原呈遞細 胞例如樹突細胞，刺激toll-樣受體（TLRs)，并誘導(dǎo)平衡的Thl/Th2免疫。另外，已經(jīng)證實， PIV構(gòu)建體可以在基質(zhì)細胞中生長至高滴度，幾乎沒有或根本沒有細胞病變效應(yīng)（CPE)，這 允許高產(chǎn)率生產(chǎn)、任選地多次收獲和/或繁殖受感染的基質(zhì)細胞。
[0008] 在圖1和2中解釋了PIV技術(shù)的原理。該技術(shù)存在兩種變體。在第一種變體中， 構(gòu)建大量缺失衣殼蛋白（C)的單組分假感染病毒（s-PIV)，使突變體病毒不能在正常細胞 中形成感染性病毒顆粒（圖1)。所述缺失不去除C蛋白的前~20個密碼子（它們含有 RNA環(huán)化序列）和在C末端的類似數(shù)目的密碼子（它們編碼病毒蛋白酶切割位點和prM的 信號肽）。s-PIV可以繁殖，例如，在生產(chǎn)過程中，在其中以反式提供C蛋白的基質(zhì)（輔助） 細胞培養(yǎng)物中，例如，在生產(chǎn)C蛋白（或包含C蛋白的更大輔助盒）的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞中， 或在含有表達C蛋白的a病毒復(fù)制子[例如，委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（VEE)復(fù)制子]或另一 種表達C蛋白的細胞內(nèi)表達載體的細胞中。在體內(nèi)接種后，例如，免疫接種后，PIV在沒有 反式互補缺失的情況下在受感染的細胞中經(jīng)歷單輪復(fù)制，不擴散至周圍細胞。受感染的細 胞生成空的病毒樣顆粒（VLP)，它們是PIV中的prM-E基因的產(chǎn)物，導(dǎo)致中和抗體應(yīng)答的誘 導(dǎo)。通過病毒表位的MHCI呈遞，也會誘導(dǎo)T-細胞應(yīng)答。該方案已經(jīng)應(yīng)用于YF17D病毒和 WN病毒和WN/JE和WN/DEN2 嵌合病毒（Mason等人，Virology351 :432-443, 2006;Suzuki 等人，J.Virol. 83 :1870-1880,2009;Ishikawa等人，Vaccine26 :2772-2781，2008;Widman 等人，Vaccine26 :2762-2771，2008 ;W0 2007/098267 ;W0 2008/137163)。
[0009] 在第二種變體中，構(gòu)建雙組分PIV(d-PIV)(圖2)。用2種缺陷型病毒RNA轉(zhuǎn)染基 質(zhì)細胞，一種缺失C基因，另一種缺失prM_E被|旲蛋白基因。2種有缺陷的基因組彼此互補， 導(dǎo)致2類PIV在細胞培養(yǎng)基中累積（Shustov等人，J.Virol. 21 :11737-11748,2007;Suzuki 等人，J.Virol.82 :6942-6951，2008)。任選地，可以在適當(dāng)?shù)妮o助細胞系中分開生產(chǎn)2種 PIV，然后在雙組分制劑中混合。后者可以提供下述優(yōu)點：調(diào)節(jié)兩種組分的相對濃度，增加免 疫原性和功效。由于有些細胞在接種部位被兩種組分共感染，這類PIV疫苗在體內(nèi)應(yīng)當(dāng)能 經(jīng)歷有限的擴散。預(yù)期這種擴散是自限制的，因為在組織中存在比起初共感染的細胞生產(chǎn) 的病毒顆粒更多的細胞。另外，相對高的M0I對于有效的共感染而言是必需的，預(yù)見到在接 種部位以外的細胞不會被有效地共感染（例如，在排出淋巴結(jié)中）。僅被ACPIV感染的細 胞生成高免疫原性的VLP。共感染的細胞生成兩類包裝的有缺陷的病毒顆粒，它們也刺激中 和抗體。預(yù)期有限的感染會導(dǎo)致比s-PIV更強的中和抗體應(yīng)答和T-細胞應(yīng)答。為了降低 在生產(chǎn)過程中或在體內(nèi)重組的機會（包括與循環(huán)的黃病毒），可以在s-PIV和d-PIV中修 飾病毒序列，例如，使用同義密碼子替換來減少核苷酸序列同源性，和突變互補的環(huán)化5'和 3'元件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供了復(fù)制缺陷型（或有缺陷的）假感染黃病毒，其包含黃病毒基因組，后 者包含：（i)編碼一種或更多種選自下述的蛋白的核苷酸序列中的一個或更多個缺失或突 變：衣殼（C)、膜前（prM)、被膜（E)、非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)、非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)和非結(jié)構(gòu)蛋白 5(NS5)，和（ii)編碼一種或更多種異源病原體、癌癥或變態(tài)反應(yīng)相關(guān)免疫原的序列。例如， 所述缺失/突變可以是在衣殼（C)序列；膜前（prM)和/或被膜（E)序列；衣殼（C)、膜前 (prM)和被膜（E)序列；或非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)序列內(nèi)。
[0011] 異源免疫原可以來自，例如，選自下述的病原體：狂犬病病毒（例如，狂犬病病毒G 蛋白表位），博氏疏螺旋體（例如，OspA免疫原，或其免疫原性片段），蜱（例如，選自64TRP、 Isac和Salp20的蜱唾液蛋白，或其免疫原性片段），流感病毒（例如，流感病毒M2,血凝素 (HA)，或神經(jīng)氨酸酶（NA)表位，或其免疫原性片段），人免疫缺陷病毒（例如，密碼子優(yōu)化 的HIVgag、tat/nef?或gpl20蛋白，或其免疫原性片段），猿免疫缺陷病毒，人乳頭狀瘤病毒 (例如，HPV16或HPV18衣殼蛋白L1或L2,或其免疫原性片段），呼吸道合胞病毒（例如，呼 吸道合胞病毒F或G糖蛋白），瘧原蟲，和結(jié)核分支桿菌（也參見下文）。
[0012] 復(fù)制缺陷型假感染黃病毒可以包含編碼膜前（prM)和/或被膜（E)蛋白的序列。 此外，復(fù)制缺陷型假感染黃病毒基因組可以選自下述病毒的基因組：黃熱病病毒，西尼羅河 病毒，蜱傳腦炎病毒，蘭加特病毒，日本腦炎病毒，登革熱病毒，和圣路易腦炎病毒，它們的 減毒株，和它們的嵌合體（也參見下文）。在不同的實施例中，所述嵌合體包括：第一種黃 病毒（例如，蜱傳腦炎病毒或蘭加特病毒）的膜前（prM)和被膜（E)序列，和第二種不同黃 病毒（例如，黃熱病，西尼羅河，或蘭加特病毒）的衣殼（C)和非結(jié)構(gòu)序列。
[0013] 復(fù)制缺陷型假感染黃病毒基因組可以包裝在顆粒中，所述顆粒包含與基因組相同 或不同的來自黃病毒的膜前（prM)和被膜（E)序列。此外，可以在一種或更多種蛋白缺失 或突變的位置，或與之組合地，插入編碼異源免疫原的序列。
[0014] 編碼異源免疫原的序列可以插入黃病毒基因組中的編碼被膜（E)蛋白的序列內(nèi)， 編碼非結(jié)構(gòu)1(NS1)蛋白的序列內(nèi)，編碼膜前（prM)蛋白的序列內(nèi)，基因間地插入編碼被膜 (E)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)的序列之間，基因間地插入編碼非結(jié)構(gòu)蛋白2B(NS2B)和非結(jié) 構(gòu)蛋白3(NS3)的序列之間，和/或作為黃病毒基因組的3'非翻譯區(qū)中的雙順反子插入。
[0015] 本發(fā)明也包括組合物，其包含如上所述的第一種復(fù)制缺陷型假感染黃病毒，和第 二種（或其它）不同復(fù)制缺陷型假感染黃病毒，后者包含含有編碼一種或更多種選自下述 的蛋白的核苷酸序列中的一個或更多個缺失或突變的基因組：衣殼（C)、膜前（prM)、被膜 (E)、非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)、非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)和非結(jié)構(gòu)蛋白5(NS5)。在這些組合物中，第二 種不同復(fù)制缺陷型假感染黃病毒中由發(fā)生缺失或突變的序列編碼的一種或更多種蛋白不 同于第一種復(fù)制缺陷型假感染黃病毒中由發(fā)生缺失的序列編碼的一種或更多種蛋白。
[0016] 本發(fā)明另外包括在受試者中誘導(dǎo)對免疫原的免疫應(yīng)答的方法，它包含，給所述受 試者施用一種或更多種如本文所述的復(fù)制缺陷型假感染黃病毒和/或組合物。在不同的實 施例中，所述受試者處于病原體感染或與癌癥或變態(tài)反應(yīng)相關(guān)免疫原有關(guān)的疾病或病癥的 危險中，但是不患有。在其它實施例中，所述受試者具有病原體感染或與癌癥或變態(tài)反應(yīng)相 關(guān)免疫原有關(guān)的疾病或病癥。本發(fā)明因而包括預(yù)防和治療方法。在這些方法中，所述免疫 原可以來自，例如，選自下述的病原體：狂犬病病毒，博氏疏螺旋體，蜱，流感病毒，人免疫缺 陷病毒，猿免疫缺陷病毒，人乳頭狀瘤病毒，呼吸道合胞病毒，瘧原蟲，和結(jié)核分支桿菌（也 參見下文）。此外，所述方法可以用于誘導(dǎo)抗黃病毒基因組編碼的蛋白（除了免疫原來源 之外）的免疫應(yīng)答。在不同的實施例中，所述受試者處于與假感染黃病毒的基因組（其包 含編碼黃病毒膜前和/或被膜蛋白的序列）相對應(yīng)的黃病毒的感染的危險中，但是不患有。 在其它實施例中，所述受試者具有與假感染黃病毒的基因組（其包含編碼黃病毒膜前和/ 或被膜蛋白的序列）相對應(yīng)的黃病毒的感染。
[0017] 本發(fā)明也包括活的、減毒的嵌合黃病毒，其包括黃熱病病毒，其中編碼膜前和被膜 蛋白的序列被替換為蜱傳腦炎病毒或蘭加特病毒的編碼膜前和被膜蛋白的序列，且所述嵌 合黃病毒的衣殼和膜前蛋白之間的信號序列包括黃熱病病毒和蜱傳腦炎或蘭加特病毒衣 殼/膜前信號序列的雜種，或其變體。在不同的實施例中，嵌合黃病毒的衣殼/膜前信號序 列包括在氨基末端區(qū)域中的黃熱病病毒序列和在羧基末端區(qū)域中的蜱傳腦炎或蘭加特病 毒序列（參見下文）。
[0018] 此外，本發(fā)明包括活的、減毒的嵌合黃病毒，其包括西尼羅河病毒，其中編碼膜前 和被膜蛋白的序列被替換為蜱傳腦炎或蘭加特病毒的編碼膜前和被膜蛋白的序列，且所述 嵌合黃病毒的衣殼和膜前蛋白之間的信號序列包括蜱傳腦炎或蘭加特病毒衣殼/膜前信 號序列，或其變體。
[0019] 本發(fā)明也包括藥物組合物，其包括一種或更多種本文所述的假感染黃病毒、組合 物、或活的、減毒的黃病毒，和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。此外，所述組合物可以包括佐 劑。
[0020] 本發(fā)明也包括復(fù)制缺陷型假感染黃病毒，其包含黃病毒基因組，后者含有在編碼 非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)、非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)或非結(jié)構(gòu)蛋白5(NS5)的核苷酸序列中的一個或更 多個缺失或突變。
[0021] 此外，本發(fā)明包括核酸分子，其與假感染黃病毒的基因組或本文所述的活的、減毒 的黃病毒的基因組相對應(yīng)，和其補體。
[0022] 本發(fā)明也提供了制備本文所述的復(fù)制缺陷型假感染黃病毒的方法，該方法包含， 將如上所述的一個或更多個核酸分子導(dǎo)入細胞中，所述細胞表達與復(fù)制缺陷型假感染黃病 毒的黃病毒基因組中缺失的任意序列相對應(yīng)的蛋白。在這些方法中，所述蛋白可以在細胞 中從第二種（或其它）不同復(fù)制缺陷型假感染黃病毒的基因組表達。在其它實施例中，所述 蛋白從復(fù)制子（例如，a病毒復(fù)制子，例如委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒復(fù)制子；參見下文）表達。
[0023] 本發(fā)明也包括含有2種或更多種復(fù)制缺陷型假感染黃病毒的組合物，其中2種復(fù) 制缺陷型假感染黃病毒選自：(a)包含含有日本腦炎病毒序列的基因組的復(fù)制缺陷型假感 染黃病毒，和包含含有登革熱病毒序列的基因組的復(fù)制缺陷型假感染黃病毒；(b)包含含 有黃熱病病毒序列的基因組的復(fù)制缺陷型假感染黃病毒，和包含含有登革熱病毒序列的基 因組的復(fù)制缺陷型假感染黃病毒；和（c)包含含有蜱傳腦炎或蘭加特病毒序列和編碼博氏 疏螺旋體免疫原的插入序列的基因組的復(fù)制缺陷型假感染黃病毒，和包含含有蜱傳腦炎或 蘭加特病毒序列和編碼蜱唾液蛋白免疫原的插入序列的基因組的復(fù)制缺陷型假感染黃病 毒，或包含含有蜱傳腦炎或蘭加特病毒序列和編碼博氏疏螺旋體免疫原和蜱唾液蛋白免疫 原的插入序列的基因組的復(fù)制缺陷型假感染黃病毒。
[0024] 本發(fā)明也包括藥物組合物，其含有本文所述的活的、減毒的嵌合黃病毒。此外，本 發(fā)明包括在受試者中誘導(dǎo)對蜱傳腦炎病毒或蘭加特病毒的免疫應(yīng)答的方法，該方法包含， 給所述受試者施用這樣的藥物組合物。在不同的實施例中，所述受試者處于發(fā)展蜱傳腦炎 病毒或蘭加特病毒感染的危險中，但是不患有。在其它實施例中，所述受試者被蜱傳腦炎病 毒或蘭加特病毒感染。
[0025] 本發(fā)明另外包括復(fù)制缺陷型假感染黃病毒，其包含含有編碼一種或更多種選自 下述的蛋白的核苷酸序列中的一個或更多個缺失或突變的黃病毒基因組：衣殼（C)、膜前 (prM)、被膜（E)、非結(jié)構(gòu)蛋白1 (NS1)、非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)和非結(jié)構(gòu)蛋白5(NS5)，其中所述黃 病毒基因組包括其中編碼膜前和被膜蛋白的序列被替換為蜱傳腦炎病毒或蘭加特病毒的 編碼膜前和被膜蛋白的序列的黃熱病病毒序列，且編碼黃病毒基因組的衣殼和膜前蛋白之 間的信號序列的序列包括編碼黃熱病病毒和蜱傳腦炎或蘭加特病毒衣殼/膜前信號序列 的序列雜種，或其變體。在不同的實施例中，所述編碼黃病毒基因組的衣殼/膜前信號序列 的序列包括在5'區(qū)的黃熱病病毒序列和在3'區(qū)的蜱傳腦炎或蘭加特病毒序列。
[0026] 此外，本發(fā)明包括復(fù)制缺陷型假感染黃病毒，其包含含有編碼一種或更多種選自 下述的蛋白的核苷酸序列中的一個或更多個缺失或突變的黃病毒基因組：衣殼（C)、膜前 (prM)、被膜（E)、非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)、非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)和非結(jié)構(gòu)蛋白5(NS5)，其中所述 黃病毒基因組包括其中編碼膜前和被膜蛋白的序列被替換為蜱傳腦炎或蘭加特病毒的編 碼膜前和被膜蛋白的序列的西尼羅河病毒序列，且編碼黃病毒基因組的衣殼和膜前蛋白之 間的信號序列的序列包括編碼蜱傳腦炎或蘭加特病毒衣殼/膜前信號序列的序列，或其變 體。
[0027]另外，本發(fā)明包括復(fù)制缺陷型假感染黃病毒，其包含含有編碼一種或更多種選自 下述的蛋白的核苷酸序列中的一個或更多個缺失或突變的黃病毒基因組：衣殼（C)、膜前 (prM)、被膜（E)、非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)、非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)和非結(jié)構(gòu)蛋白5(NS5)，其中黃病 毒基因組中的任意衣殼（C)和非結(jié)構(gòu)（NS)蛋白來自蘭加特病毒，且任意膜前（prM)和被膜 (E)蛋白來自蜱傳腦炎病毒。
[0028] "復(fù)制缺陷型假感染黃病毒"或"PIV"是指，由于黃病毒基因組中的缺失和突變，復(fù) 制有缺陷的黃病毒。所述缺失或突變可以是，例如，大序列的缺失，例如本文所述的大部分 衣殼蛋白（保留環(huán)化序列；參見下文）。在其它實施例中，缺失編碼不同蛋白（例如，prM， E，NS1，NS3,和/或NS5 ;參見下文）或蛋白組合（例如，prM-E或C-prM-E)的序列。如果 PIV要用作遞送異源免疫原的載體，這類缺失可能是有利的，因為缺失可以允許插入例如至 少多達缺失序列的大小的序列。在其它實施例中，突變可以是，例如，點突變，條件是，它導(dǎo) 致如上討論的復(fù)制缺陷。因為缺失和突變，基因組不編碼生成完整黃病毒顆粒所需的所有 蛋白。缺失序列可以由構(gòu)建成表達該缺失序列的補償細胞系以反式提供（例如，利用復(fù)制 子；s-PIV;參見下文），或通過2個復(fù)制缺陷型基因組在相同細胞中的共表達，其中所述2 個復(fù)制缺陷型基因組當(dāng)一起考慮時，會編碼生產(chǎn)所需的所有蛋白（d-PIV系統(tǒng)；參見下文）。
[0029] 在導(dǎo)入不表達補償?shù)鞍椎募毎泻?，基因組復(fù)制，且在有些情況下，產(chǎn)生"病 毒-樣顆粒"，它們從細胞釋放出來，且能離開細胞和成為免疫原性的，但是不能感染其它細 胞和導(dǎo)致其它顆粒的生成。例如，在包含