一種克隆胚胎構(gòu)建的改進方法
【專利說明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及克隆技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種克隆胚胎構(gòu)建的改進方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 動物克隆是指動物不經(jīng)過有性生殖的方式而直接獲得與親本具有相同遺傳性狀 后代的過程，包括孤雌生殖、卵裂球分離與培養(yǎng)、胚胎分割以及細(xì)胞核移植等。目前，廣為人 知的動物克隆技術(shù)實際上就是指細(xì)胞核移植技術(shù)。傳統(tǒng)的細(xì)胞核移植技術(shù)通常是指通過 顯微操作的方法，將供體細(xì)胞的細(xì)胞核注入預(yù)先去核的成熟卵母細(xì)胞或早期合子內(nèi)，形成 一個新的重構(gòu)胚，重構(gòu)胚經(jīng)過融合激活后發(fā)生發(fā)育程序重編，經(jīng)細(xì)胞分裂、分化并在代孕母 體內(nèi)發(fā)育成一個新的個體。包括卵母細(xì)胞去核、注供體細(xì)胞、融合供體細(xì)胞并激活、體外培 養(yǎng)、胚胎移植等一系列操作的復(fù)雜過程，每一個操作步驟都會影響到核移植的最終效率。自 1997年〃Dolly〃羊出生以來，研究者就不斷對核移植過程中的每個技術(shù)環(huán)節(jié)進行改進。手 工克?。╤andmade cloning，HMC)技術(shù)改進去核操作步驟，在體視顯微鏡下用特制的切割 刀直接切割去核，然后將兩個不含有細(xì)胞核的半卵與一個供體細(xì)胞靠近并施以直流電脈沖 使其融合，最后將重構(gòu)胚單個培養(yǎng)。整個過程不需要顯微操作儀，Vajta等（Vajta et al， 2001)將其稱之為手工克隆。杜玉濤（2011)研究表明與傳統(tǒng)的體細(xì)胞核移植相比，手工克 隆技術(shù)能大幅度提高體細(xì)胞核移植的囊胚率。
[0004] 將卵母細(xì)胞質(zhì)中的核去除掉，這個過程稱之為去核。卵母細(xì)胞的去核是體細(xì)胞核 移植技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，在去除盡量少胞質(zhì)的情況下同時保證去核干凈。若胞質(zhì)去除過 多，會使卵母細(xì)胞內(nèi)累積的蛋白質(zhì)，mRNA流失過多，影響供體細(xì)胞的重編程。若去核不完全 會導(dǎo)致重構(gòu)胚染色體非整倍性，造成多倍體，卵裂異常，發(fā)育受阻，胚胎早期死亡等。去核效 率的高低直接關(guān)系到所構(gòu)建克隆胚胎體外發(fā)育和受體移植妊娠率及產(chǎn)犢率的高低。
[0005] 傳統(tǒng)細(xì)胞核移植技術(shù)的去核方法有盲吸去核法，染色去核法和spindle-view法。 但是每種方法都存在一定的缺點，人們一直在尋求更好的方法。比如(劉東，2004)的擠壓去 核法，用玻璃針在極體附近透明帶刺穿一個切口，推擠卵母細(xì)胞，使第一極體連同其附近 的1/4~1/3胞質(zhì)溢出透明帶。（郭繼彤，2002)用蔗糖高滲溶液對牛卵母細(xì)胞進行短時培 養(yǎng)，大部分卵母細(xì)胞的紡錘體部位突出于卵膜表面，指示去核操作。這些都是在嘗試對卵 母細(xì)胞的去核操作方法進行改進。后來發(fā)展起來的手工克隆技術(shù)（Vajta 2007)直接用刀 切除一半卵，以達到去核干凈的目的。
[0006] 盲吸去核法（圖2)是根據(jù)成熟卵母細(xì)胞的特點，去除極體附近的約1/3胞質(zhì)，達到 去核目的，操作簡潔迅速，但是去核過程中會使卵母細(xì)胞第一極體的位置發(fā)生改變，影響去 核效果，去核效率相對較低，一般在70%。染色法去核利用DNA特異性染料H〇echeSt33342 將整個卵母細(xì)胞染色后，借助熒光顯微鏡顯示染色體去核的方法，可以去除少量胞質(zhì) 和保證100%去干凈，但是紫外線的照射會損傷胚胎活力（Tsunda，1988)。后來發(fā)展的 spindle-view法，是利用偏振光折射直接獲取紡錘體鏡像，不需要染色就能觀察到卵母細(xì) 胞內(nèi)的紡錘體，去核率可以達到95%以上，但是價格昂貴，不利于推廣應(yīng)用。手工去核直接 用刀切，相對去除的胞質(zhì)更多（圖1)，然后再將2枚半卵融合彌補去除胞質(zhì)過多的情況。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種克隆 胚胎構(gòu)建的改進方法。
[0008] 本發(fā)明所要解決的上述技術(shù)問題通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)： 一種克隆胚胎構(gòu)建的改進方法，包含如下步驟： 51. 將卵母細(xì)胞置于操作液滴A中，利用盲吸法完成去核操作； 52. 將去除細(xì)胞核的胞質(zhì)部分置于染色液滴中，直接在熒光鏡下觀察胞質(zhì)的著色情況， 然后將對應(yīng)的去核干凈的卵母細(xì)胞備用； 53. 將去核干凈的卵母細(xì)胞放入操作液滴B中靜置，然后移放到含有供體細(xì)胞的操作 液滴C中，先將一枚卵母細(xì)胞與一枚供體細(xì)胞粘合，然后再與另一枚卵母細(xì)胞粘合在一起， 其排列順序為體細(xì)胞一卵細(xì)胞一卵細(xì)胞； 54. 將粘合好的體細(xì)胞一卵細(xì)胞一卵細(xì)胞先在融合激活液中靜置，再移到融合槽中進 行電融合，即得克隆胚胎。
[0009] 本發(fā)明所述的克隆胚胎構(gòu)建的改進方法，是發(fā)明經(jīng)過大量的實驗摸索而得到的， 該方法綜合了幾種現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點，摒棄了其缺點；如吸收了盲吸法（圖2)操作簡潔迅速 的優(yōu)點，克服了其去核效率相對較低的缺點；采用了改進的染色法，吸收了染色方法去核干 凈(去核率100%)且效率高的優(yōu)點，又避免了傳統(tǒng)方法中卵母細(xì)胞被紫外光照射，損傷胚胎 活力的缺點；最后結(jié)合改進的手工克隆技術(shù)，融合更多的胞質(zhì)，從而提尚效率。
[0010] 優(yōu)選地，所述的卵母細(xì)胞為豬卵母細(xì)胞；所述的供體細(xì)胞為豬供體細(xì)胞。
[0011] 優(yōu)選地，S1.中所述的操作液滴A由無鈣的H-NCSU-23和7. 5 y g/ml細(xì)胞松弛素B (CB)組成； 52. 中所述的染色液滴由無鈣的H-NCSU-23和10 y g/ml的Hoechst33342組成； 53. 中所述的操作液滴B由無鈣的H-NCSU-23和2mg/mL的植物凝集素（PHA)組成； S3.中所述的操作液滴C為無鈣的H-NCSU-23。
[0012] 優(yōu)選地，S2.中所述的在熒光鏡下觀察胞質(zhì)的著色情況的判斷方法為：若胞質(zhì)只 有1個點不發(fā)亮（圖4)，則證明去核不干凈；若胞質(zhì)有2點發(fā)亮（圖5)，則證明對應(yīng)的卵母細(xì) 胞去核干凈。
[0013] 優(yōu)選地，S3.中所述的靜置時間為l~10s。
[0014] 優(yōu)選地，S4.中所述的靜置時間為l~5min。
[0015] 優(yōu)選地，S4.中所述的融合激活液含有如下組分：0? 25mol/LMannitol，0. lmmol/L CaC12 ? 2H20,0. lmmol/L Mg-C12 ? 6H20,0. 5mmol/L HEPES，0. 01% PVA(w/v)。
[0016] 優(yōu)選地，S4.中所述的電融合使用直流電進行，參數(shù)為：80V/mm，100 y s，脈沖次 數(shù)為2~3次。
[0017] 優(yōu)選地，在S4.中所述的融合槽中，卵母細(xì)胞胞質(zhì)緊挨電極的一端，體細(xì)胞位于融 合槽的中間。
[0018] 優(yōu)選地，S1.中所述的去核操作和S2.中所述的染色操作在操作盤內(nèi)完成操作；所 述的操作盤（圖3)做成4排，每排含5個液滴，其中一排含操作液滴，緊鄰 的一排含染色液滴。
[0019] 有益效果：本發(fā)明提供一種全新的克隆胚胎構(gòu)建方法，其具有操作簡潔迅速、去核 干凈且效率高、克隆效率高等優(yōu)點；此外，經(jīng)本發(fā)明方法得到的克隆胚胎可顯著提高胚胎體 外發(fā)育的囊胚率。
【附圖說明】
[0020] 圖1為手工去核技術(shù)示意圖。
[0021 ] 圖2為盲吸法去核技術(shù)示意圖。
[0022] 圖3為操作盤圖。
[0023] 圖4為焚光鏡下去核不干凈的胞質(zhì)圖（A白光；B焚光)。
[0024] 圖5為焚光鏡下去核干凈的胞質(zhì)圖（A白光；B焚光)。
[0025] 圖6為熒光顯微下鏡囊胚細(xì)胞計數(shù)圖。
【具體實施方式】
[0026] 以下結(jié)合具體實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例對本發(fā)明不做任何形式的限 定。
[0027]實驗研究所用試劑未經(jīng)特殊說明均購自SIGMA公司。胎牛血清（GIBC0)，生理鹽 水(紫光古漢集團衡陽制藥有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)耗材為Corning公司產(chǎn)品；卵母細(xì)胞 成熟及細(xì)胞、胚胎培養(yǎng)耗材為NUNC公司產(chǎn)品。洗卵液為DPBS+PVA液，操作液為無鈣的 H-N