microRNA熒光檢查定量的內(nèi)參化合物和引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于脊髓miRNA檢測(cè)的內(nèi)參化合物及其檢測(cè)引物與應(yīng)用，屬于分 子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 普通人群中慢性疼痛的發(fā)生率約為35%~45%，且近年呈上升趨勢(shì)，慢性疼痛已 成為最常見臨床病癥之一，且由于缺乏行之有效的治療方法和藥物而嚴(yán)重影響人們的生活 質(zhì)量。早期診斷和治療可提高慢性疼痛病人的治療效果并改善預(yù)后，因此尋找具有較高特 異性和敏感性的實(shí)用診斷方法是十分必要的。目前慢性疼痛常用治療方法主要有全身藥物 治療法、神經(jīng)阻滯療法、小刀療法、物理療法和枝川療法等。其中藥物療法是主要療法，但由 于仍缺乏理想治療方法和鎮(zhèn)痛藥物，因此出現(xiàn)藥物耐受或療效不佳等狀況。神經(jīng)阻滯療法 和物理療法也是常見臨床慢性疼痛治療方法，但其療效有效，亦不能根本上治療慢性疼痛。 由于脊髓作為傷害性信號(hào)傳遞的中樞第一站，是疼痛信號(hào)傳遞和調(diào)控的關(guān)鍵部位，因此，研 究脊髓水平基因調(diào)控的慢性疼痛機(jī)制有可能抓住慢性疼痛發(fā)生和維持的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也將有 助于研究慢性疼痛發(fā)病機(jī)理及獲得有效的防治措施。這也是臨床及基礎(chǔ)研究科學(xué)家們長(zhǎng)期 致力于研究脊髓神經(jīng)元可塑性介導(dǎo)慢性發(fā)生機(jī)制的主要原因。
[0003] 微小RNA(microRNA，miRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)調(diào)控的一種方式，它參與調(diào) 節(jié)多種生理和病理過(guò)程。目前，已在動(dòng)物的多數(shù)組織中發(fā)現(xiàn)有調(diào)節(jié)功能的miRNA。2006年 首次在腦中發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸功能的miR-13,隨后又在脊髓和周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)多個(gè) miRNA，它們通過(guò)調(diào)節(jié)突觸可塑性，在多種神經(jīng)退行性疾病形成中發(fā)揮著重要作用。提示， miRNA作為基因表達(dá)調(diào)控的新機(jī)制為進(jìn)一步闡明神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)理及其尋求臨 床治療學(xué)的突破提供可能。Zhao等2010年將miRNA調(diào)控引入疼痛研究領(lǐng)域，這對(duì)探討慢性 疼痛發(fā)生的新機(jī)制具有重大意義。隨后，F(xiàn)avereaux等研究了 miR-103介導(dǎo)慢性疼痛的發(fā)生 過(guò)程，發(fā)現(xiàn)CFA疼痛小鼠脊髓背角miR-103表達(dá)明顯降低，當(dāng)脊髓背角miR-103過(guò)表達(dá)時(shí)， 鈣離子通道Cavl. 2-LTC的表達(dá)則明顯下降，小鼠痛閾顯著升高。miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)突觸可塑 性參與了慢性疼痛過(guò)程。因此，檢測(cè)脊髓miRNA可為慢性疼痛預(yù)測(cè)、診斷與監(jiān)測(cè)開辟新的途 徑。
[0004] 目前，miRNA檢測(cè)技術(shù)主要包括高通量測(cè)序技術(shù)、基因芯片技術(shù)、原位雜交和實(shí)時(shí) 熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)。前兩者屬于高通量方法，主要用于miRNA篩選，對(duì)于獲得 miRNA的準(zhǔn)確定量需采用qRT-PCR方法；原位雜交檢測(cè)方法是對(duì)組織內(nèi)單一miRNA的在體 定性檢測(cè)，因其分析費(fèi)時(shí)成本高常用于miRNA的在體驗(yàn)證。qRT-PCR因其是能夠準(zhǔn)確、操作 簡(jiǎn)單、低成本對(duì)單一目標(biāo)miRNA進(jìn)行定性定量分析及驗(yàn)證，是miRNA分析方法中最為常用 檢測(cè)技術(shù)。在進(jìn)行脊髓qRT-PCR操作過(guò)程中，為獲得準(zhǔn)確miRNA結(jié)果，常采用如下3種操 作方法。一是提取RNA時(shí)取等量脊髓，二是在提取RNA之前向等量脊髓加入等量人工合成 miRNA(如線蟲miRNA-39)，三是采用內(nèi)源性分子作為檢測(cè)脊髓miRNA表達(dá)內(nèi)參化合物。然 而，前兩種方法由于操作誤差在所難免，決定了它們對(duì)于有效獲得生物體內(nèi)miRNA含量的 不確定性。與前兩者不同的是，采用內(nèi)源性miRNA分子作為檢測(cè)脊髓miRNA表達(dá)內(nèi)參化合 物，不僅可以控制實(shí)驗(yàn)操作中的誤差，還可以控制樣本本身生物學(xué)差異，具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，因 而成為業(yè)界所公認(rèn)的最佳標(biāo)準(zhǔn)化方法。
[0005] 目前，在慢性疼痛脊髓miRNA研究中，尚缺乏公認(rèn)較為穩(wěn)定的內(nèi)參化合物分子，以 往研究者主要根據(jù)自身經(jīng)驗(yàn)或者參考文獻(xiàn)來(lái)選擇內(nèi)參化合物分子，不同實(shí)驗(yàn)中選取內(nèi)參化 合物有很大差異，因而制約了研究成果轉(zhuǎn)化和不同研究者間所獲檢測(cè)結(jié)果的比較。因此，若 能發(fā)現(xiàn)用于慢性疼痛脊髓miRNA分析內(nèi)參化合物并研發(fā)出相應(yīng)試劑盒，使之能應(yīng)用于科研 領(lǐng)域，將極大地促進(jìn)慢性疼痛脊髓miRNA研究及科研成果的轉(zhuǎn)化，對(duì)于慢性疼痛臨床診療 和藥物開發(fā)必將起到巨大推動(dòng)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，為解決現(xiàn)有技術(shù)中尚無(wú)穩(wěn)定檢測(cè)慢性疼痛脊髓 miRNA內(nèi)參化合物分子的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選，提供一種用于慢性疼痛脊髓 miRNA檢測(cè)的內(nèi)參化合物，并提供檢測(cè)該內(nèi)參化合物的引物、專用試劑盒、檢測(cè)方法，以及在 診斷、檢測(cè)慢性疼痛中的應(yīng)用，為慢性疼痛脊髓miRNA研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提供實(shí)用可靠的標(biāo) 準(zhǔn)化依據(jù)。
[0007] 技術(shù)方案，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] -種用于慢性疼痛脊髓miRNA檢測(cè)的內(nèi)參化合物，該內(nèi)參化合物為單獨(dú)的 mmu-miR-486-5p;其序列為：uccuguacugagcugccccgag，序列如 SEQ ID NO 1 所不。
[0009] 檢測(cè)mmu-miR-486-5p的引物包括反轉(zhuǎn)錄引物，正向擴(kuò)增引物和反向擴(kuò)增引物；反 轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQ ID N0 2所示；正向擴(kuò)增引物的序列如SEQ ID N0 3;反向擴(kuò)增引物 的序列如SEQ ID N0 4所示；
[0010] mmu-miR-486_5p 反轉(zhuǎn)錄引物為：
[0011] 5' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCGGGGC-3'；
[0012] mmu-miR-486-5p 的正向擴(kuò)增引物：5' -GCCCTGTCCTGTACTGAGCTGCC-3'
[0013] mmu-miR-486-5p 的反向擴(kuò)增引物：5' -GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。
[0014] 本發(fā)明所述的用于慢性疼痛下脊髓miRNA檢測(cè)的內(nèi)參化合物mmu-miR-486-5p在 制備慢性疼痛脊髓miRNA檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明所述的用于慢性疼痛下脊髓miRNA檢測(cè)的內(nèi)參化合物mmu-miR-486-5p的 引物在制備慢性疼痛脊髓miRNA檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
[0016] 作為優(yōu)選方案，以上所述的慢性疼痛脊髓miRNA檢測(cè)試劑盒，包含用于miRNA提取 及qRT-PCR反應(yīng)所需的RNA分離液、試劑和酶，以及標(biāo)準(zhǔn)品或/和對(duì)照品。
[0017] 作為優(yōu)選方案，以上所述RNA分離液由吐溫20、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙 酸、牛血清白蛋白和水組成，各組分的濃度如下：吐溫20的體積百分?jǐn)?shù)為2.0%，三羥甲基 氨基甲燒：45mmol/L，乙二胺四乙酸：1. 2mmol/L，牛血清白蛋白的體積百分?jǐn)?shù)為1. 5%，余 量為水。
[0018] 所述PCR反應(yīng)液由lXSyberGreen I熒光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羥甲基氨 基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀、氯化鎂和水組成，其中，各物質(zhì)的濃度如下：DNA聚合酶：100U/mL ; dNTPs :0. 2mM ;氯化鎂：6mM ;三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽：16. 5mM ;氯化鉀：89. 3mM。
[0019] 利用上述慢性疼痛脊髓miRNA內(nèi)參化合物檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)方法，包括以下步 驟：
[0020] (1)冰上分離得到脊髓樣本，提取RNA (包括miRNA);
[0021] (2) qRT-PCR反應(yīng)：將上述分離脊髓miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取cDNA為模板，加 入引物和PCR反應(yīng)液，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)樣本閾值Ct ;
[0022] (3)結(jié)果分析：根據(jù)脊髓miRNA內(nèi)參化合物mmu-miR-486-5p樣本閾值Ct內(nèi)參化 合物校正脊髓目的miRNA樣本閾值Ct，以判斷目的miRNA表達(dá)水平是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0023] 本發(fā)明可用于檢測(cè)慢性疼痛下脊髓miRNA內(nèi)參化合物mmu-miR-486-5p，并可檢測(cè) 脊髓目的miRNA分子，其檢測(cè)效能穩(wěn)定可靠，具有廣泛應(yīng)用前景。
[0024] 本發(fā)明的用于慢性疼痛脊髓miRNA檢測(cè)的內(nèi)參化合物，優(yōu)點(diǎn)如下：
[0025] (1)慢性疼痛脊髓內(nèi)參mmu-miR-486-5p化合物miRNA檢測(cè)試劑盒可用于檢測(cè)小鼠 脊髓miRNA，進(jìn)而確定不同動(dòng)物脊髓內(nèi)參化合物miRNA線水平，以消除由于個(gè)體生物學(xué)差異 及實(shí)驗(yàn)操作所導(dǎo)致的miRNA表達(dá)水平差異，使得真正與慢性疼痛相關(guān)miRNA表達(dá)水平差異 得到準(zhǔn)確差異性表達(dá)分析。
[0026] (2)本發(fā)明采用嚴(yán)密的設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)體系，首先通過(guò)Solexa測(cè)序得到慢性疼痛下脊 髓miRNA表達(dá)譜，經(jīng)比較分析篩選出表達(dá)穩(wěn)定的miRNA，再經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)和軟件計(jì)算得到 較穩(wěn)定候選內(nèi)參化合物。通過(guò)應(yīng)用上述研究方法，可保證慢性疼痛脊髓miRNA內(nèi)參化合物 檢測(cè)試劑盒研發(fā)的嚴(yán)謹(jǐn)性和可靠性。
[0027] 本發(fā)明通過(guò)篩選脊髓中穩(wěn)定表達(dá)的miRNA，尋找并驗(yàn)證了可用作慢性疼痛脊 髓miRNA研究的內(nèi)參mmu-miR-486-5p化合物。通過(guò)慢性疼痛脊髓miRNA內(nèi)參化合物 mmu-miR-486-5p檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，可促進(jìn)慢性疼痛脊髓miRNA研究成果轉(zhuǎn)化及不同科研 者間學(xué)術(shù)交流，也可為獲得靶向miRNA的鎮(zhèn)痛藥物研發(fā)提供新思路和新途徑。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1為不同miRNA分子在正常組和疼痛組脊髓內(nèi)表達(dá)。
[0029] 圖2為miR-486_5p在不同批次的對(duì)照組和疼痛組樣本中的表達(dá)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
[0031] 本發(fā)明的試驗(yàn)研究包括以下步驟：
[0032] (1)小鼠慢性疼痛模型的制備；
[0033] (2)以標(biāo)準(zhǔn)操作程序采集脊髓樣本，提取RNA ;
[0034] (3)脊髓miRNA表達(dá)譜分析：選取慢性疼痛小鼠與生理鹽水注射作為對(duì)照的小鼠， 高通量測(cè)序后分析兩者表達(dá)譜，篩選出穩(wěn)定表達(dá)的候選內(nèi)參化合物miRNA用以進(jìn)一步驗(yàn) 證，排除部分不符合要求的分子，對(duì)剩余分子采用軟件分析；
[0035] (4)對(duì)候選內(nèi)參化合物miRNA用定量PCR進(jìn)行定性分析驗(yàn)證，以確定各候選miRNA 的穩(wěn)定性；
[0036] (5)慢性疼痛脊髓miRNA內(nèi)參化合物檢測(cè)試劑盒的研發(fā)：根據(jù)所選定的miRNA，研 發(fā)內(nèi)參化合物檢測(cè)試