2(D):流式檢測共表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞后對細胞凋亡的影響；
[0035] 圖3示重組病毒的生物學活性；圖3 (A)示AAV-EGFP可以成功侵染293細胞和 A549細胞并使其表達綠色熒光蛋白；圖3 (B) AAV-TRAIL和AAV-TRAIL+miR-222-TuD在侵染 293細胞后可以成功過表達TRAIL ;圖3 (C) AAV-TRAIL+miR-222-TuD可以有效敲低miR-222 的表達水平；
[0036] 圖4示A549荷瘤小鼠經(jīng)重組AAV-TRAIL和AAV-TRAIL+miR-222-TuD處理后，皮下 瘤的生長受到抑制，并且AAV-TRAIL+miR-222-TuD能促進AAV-TRAIL的使用效果，明顯抑制 腫瘤生長；圖4(A)皮下瘤受抑制的形態(tài)學觀察；圖4(B)給藥后瘤體積變化的動態(tài)觀察；處 圖4(C)死時瘤重的差異；
[0037] 圖5示miR-222-TuD通過調(diào)節(jié)靶基因PTEN的變化水平發(fā)揮作用結(jié)果：圖5 (A)示 PTEN是miR-222靶基因；圖5(B)示miR-222-TuD在體內(nèi)可以上調(diào)PTEN表達水平。
【具體實施方式】
[0038] 本發(fā)明公開了一種RNA及其用途、包含該RNA的組合物、重組表達載體和宿主細 胞，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有 類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本 發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi) 容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本 發(fā)明技術(shù)。
[0039] 本發(fā)明的第一個目的在于提供Hsa-miR-222在不同細胞系中對TRAIL抗性的影 響。
[0040] 所述不同細胞系為HeLa細胞、A549細胞、Bel-7402細胞、CNE-2Z細胞、EC109細 胞、MGC-803細胞、SW1990細胞、DU145細胞、U251細胞、A875細胞、HCT116細胞、MCF7細 胞、SK-0V-3細胞。
[0041] 本發(fā)明的第二個目的在于提供一種載體，所述載體表達TRAIL95 281 (編碼TRAIL第 95至281位氨基酸）蛋白。
[0042] 本發(fā)明的第三個目的在于設(shè)計Hsa-miR-222特異性抑制劑TuD，其序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0043] 所述特異性抑制劑TuD可以介導miRNA的降解，其構(gòu)建入載體中的DNA序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0044] 本發(fā)明的第四個目的在于提供一種分泌型的可溶性人TRAIL95 281和miR-222的抑 制劑TuD共表達載體的制備方法，此表達載體的結(jié)構(gòu)為pAM-CAG-pL-INS-TRAIL 95 2S1-polyA-U6-miR-222-TuD-WPRE-BGH polyA 的 AAV 重組表達載體，簡稱 AAV-TRAIL-miR-222-TuD。
[0045]所述載體包括：pAM(the abbreviation of the plasmid of anti-ampcilin construction)、ITR(adeno_associated virus 2 inverted terminal repeat sequence)、 CAG (cytomegalovirus immediated-earlyenhancer/chicken0-actin hybrid)、 INS (human Insulin) secretion signal peptide、pL(poly_linker)、TRAIL95 281(編碼TRAIL 第95至281位氨基酸）、polyA(多聚腺苷酸）、U6、miR-222-TuD、WPRE (Woodchuck H印titis Virus Posttranscriptional Regulatory Element)、BGH(Bos taurus growth hormone)、 polyA (多聚腺昔酸）和ITR(adeno-associated virus 2 inverted terminal repeat sequence)〇
[0046]其中，ITR sequence (Patent W00220748)的序列如SEQ ID No. 5所示；CAG sequence的序列如SEQ ID No. 6所亦；INS secretion signal peptide sequence (Genbank accession no. NM 000207)的序列如SEQ ID No. 7所；^;;WPRE sepuence(Genbank accession no. J04514)的序列如SEQ ID No. 8所不；；BGH(Bos taurus growth hormone) pA sequence的序列如SEQ ID No.9所不；；TRAIL95281amino acid sequence (Patent ZL03138357. 2)的序列如SEQ ID No. 10所示。
[0047] 所述載體為質(zhì)?；虿《?，所述病毒為腺相關(guān)病毒。
[0048] 本發(fā)明的第五個目的在于提供一種組合物，包括TRAIL95 281和抑制Hsa-miR-222 的 RNA〇
[0049] 所述組合物中，所述抑制Hsa-miR-222的RNA為TuD，其序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0050] 本發(fā)明的第六個目的在于提供上述任一項的載體、組合物或細胞株在治療癌癥或 腫瘤中的用途。
[0051] 所述癌癥或腫瘤為原發(fā)性、繼發(fā)性或轉(zhuǎn)移性的腫瘤。
[0052] 所述的用途中，所述腫瘤包括宮頸癌、肺癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌、結(jié)直腸癌、胃 癌、胰腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌。
[0053] 在本發(fā)明中，采用基因工程等現(xiàn)代生物學技術(shù)和方法，提供了編碼人TRAIL95 2SJP miR-222-TuD重組AAV共表達載體和病毒的制備、包裝、及其應(yīng)用。
[0054] 本發(fā)明提供了 RNA及其用途、包含該RNA的組合物、重組表達載體和宿主細胞。其 中，如無特殊說明，實施例中涉及的各種反應(yīng)試劑均可以通過商業(yè)渠道購買得到；如無特殊 說明，實施例中涉及的具體操作參見《分子克隆實驗指南第三版》。
[0055] 下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：
[0056] 實施例1 miR-222對TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡活性的影響采用CCK-8法檢測
[0057] 分別取 2 X 105的 HeLa 細胞、A549 細胞、Bel-7402 細胞、CNE-2Z 細胞、EC109 細胞、 MGC-803 細胞、SW1990 細胞、DU145 細胞、U251 細胞、A875 細胞、HCT116 細胞、MCF7 細胞、 SK-0V-3細胞（體積為2ml)接種到6孔板中，分別轉(zhuǎn)染由Invitrogen公司人工合成的模擬 物對照、miR-222模擬物、抑制劑對照、miR-222抑制劑48h以后，將細胞消化下來接種于96 孔板中，每孔8000個細胞，加入TRAIL蛋白至終濃度100ng/ml，刺激24h，去掉培養(yǎng)基，每孔 加入110 y 1含CCK-8的培養(yǎng)基（100 y 1培養(yǎng)基加10 y 1 CCK-8)，37°C溫育，每隔一小時于 MD/SPECTRA MAX 340分光光度儀上讀取450nm處光吸收值，計算細胞成活率（細胞成活率 =實驗組光吸收值/對照組光吸收值X 100% )。每一組設(shè)定五個樣品孔，每組實驗重復三 次。
[0058] miR-222過表達能夠引起細胞對TRAIL的抗性，具體見圖1 (A)~圖1 (C)。
[0059] 轉(zhuǎn)染了miR-222的模擬物和抑制劑以后，再用TRAIL蛋白刺激人宮頸癌細胞Hela、 人肺腺癌細胞A549、人肝癌細胞Bel-7402、人鼻咽癌細胞CNE-2Z、人食管癌細胞EC109、人 胃癌細胞MGC-803、人胰腺癌細胞SW1990、人前列腺癌細胞DU145、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251、 人黑色素瘤細胞A875、人乳腺癌細胞MCF7、人結(jié)直腸癌細胞HCT116、人卵巢癌細胞SK-0V-3 對細胞的殺傷作用。
[0060] 實施例 2 pAM/CAG-TRAIL-polyA-U6-miR-222-TuD 共表達質(zhì)粒的構(gòu)建
[0061] 將U6啟動子（如SEQ ID No. 3所示）用PCR擴出來以后用Taq酶加a，切膠回收， 連入到T載體中。同時人工合成polyA尾序列GGCCGCAATAAAATATCTTTAITITCATTACATCTG TGTGITGGITITIT (如SEQ ID No. 4所示），退火，用EcoRV單酶切連入了 U6啟動子的T載體 (EcoRV酶切位點在U6啟動子的上游），將polyA序列以平端方式連入T載體中，得到polyA 和U6啟動子串聯(lián)的序列。人工合成miR-222-TuD序列，并在上游加上Spel酶切位點黏末 端，在下游加上Hindlll酶切位點和SacI酶切位點黏末端，同時用Spel和SacI雙酶切連 有polyA和U6的T載體（Spel和SacI在U6的下游），將miR-222-TuD序列連入其中，得 到 P〇lyA-U6-miR-222-TuD串聯(lián)的序列。這樣以來，在polyA上游的T載體上有一個原本存 在的Hindlll酶切位點，而在miR-222-TuD的下游，有一個我們自己引入的Hindlll酶切位 點，用Hindlll單酶切該重組T載體，切膠純化得到我們的目的序列，同時Hindlll單酶切 已預先存在的pAM/CAG-TRAIL的rAAV2包裝載體（Hindlll酶切位點在TRAIL的下游），將 兩部分用T4連接酶連接在一起，測序鑒定正反向，得到目的重組質(zhì)粒。經(jīng)驗證功能，TRAIL 和miR-222-TuD聯(lián)合應(yīng)用的治療效果很好，因而采用輔助病毒缺陷包裝系統(tǒng)進行該重組 AAV-TRAIL-miR-222-TuD載體的包裝，病毒分別采用碘克沙醇密度梯度超速離心純化，超濾 濃縮，Real-time PCR確定其最終滴度。
[0062] pAM/CAG-TRAIL-U6-miR-222-TuD共表達質(zhì)粒的構(gòu)建及功能驗證結(jié)果：
[0063] 圖2⑷示miR-222-TuD的序列設(shè)計；
[0064] 圖 2 (B)示 pAM/CAG-TRAIL-polyA-U6-miR-222-TuD 共表達載體的表達結(jié)構(gòu)；
[0065] 圖2 (C)示共表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后對miR-222表達水平的影響；
[0066] 圖2 (D)示流式檢測共表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞后對細胞凋亡的影響。
[0067] 實施例3重組AAV-TRAIL+miR-222-TuD及其生物學活性測定
[0068] 人胚