利用RNAi沉默翻譯起始因子基因培育抗花葉病甘蔗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種培育甘蔗抗病品種的方法，具體涉及一種利用RNAi沉默翻譯起 始因子基因培育抗甘蔗花葉病品種的方法，即利用RNAi技術(shù)干擾甘蔗中真核翻譯起始因 子基因SceIF4El和SceIF4E2培育抗甘蔗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘鹿（Saccharum sp. hybrid)是我國(guó)乃至全世界最重要的糖料作物和能源作物， 甘蔗糖占我國(guó)食糖總量的92%，占世界食糖總量的74%，甘蔗乙醇占世界生物質(zhì)燃料乙醇 的60%。甘蔗花葉病是嚴(yán)重危害甘蔗生產(chǎn)的病毒性病害之一，在我國(guó)廣西、云南、廣東、海南 等地蔗區(qū)普遍發(fā)生（李文鳳等，2007 ;許東林等，2008)。甘蔗感染花葉病后，葉片出現(xiàn)黃綠 相間、大小不一的條紋，種苗萌芽率下降，分蘗減少，植株矮小，生長(zhǎng)緩慢，品質(zhì)變劣，蔗糖結(jié) 晶率下降（Joyce et al.，1998 ;Wu et al.，2012 ;Li et al.，2013)。甘鹿花葉病的病原主 要有3種，即甘蔗條紋花葉病毒SCSMV，甘蔗花葉病毒（Sugarcane Mosaic Virus, SCMV)和 高梁花葉病毒（Sorghum mosaic virus, SrMV)，均屬于馬鈴墓Y病毒科（Potyviridae)(李 文鳳等，2007 ;許東林等，2008 ;Xu et al.，2008 ;熊果如等，2011)。SCMV和SrMV屬于馬 鈴薯Y病毒屬（Potyvirus)。SCSMV于1978年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，1998年確定其屬于 Potyviridae，2012 年國(guó)際病毒分類委員會(huì)（International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)將其立為該科新屬，即禾病毒屬（Poacevirus) (http://www. ictvonline. org)。SCSMV主要分布在中國(guó)、孟加拉、印度、日本、印度尼西亞、巴基斯坦等地，在中國(guó)甘蔗 主產(chǎn)區(qū)廣西、云南呈現(xiàn)爆發(fā)式流行，在廣東、浙江和福建等地普遍發(fā)生并廣泛傳播（Li et &1.，2011)，田間發(fā)病率達(dá)到50%時(shí)，產(chǎn)量損失高達(dá)20%(?11廿3 6七&1.，2013)。
[0003] SCMV，SrMV和SCSMV均為單鏈正義RNA病毒，基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，長(zhǎng)度約為10Kb， 編碼一個(gè)大的多聚蛋白（ployprotein)，經(jīng)酶解后形成10個(gè)成熟蛋白，從N端到C端依次 為：第一蛋白（P1)、輔助成分-蛋白酶（helper component proteinase，HC-Pro)、第三蛋 白（P3)、第一個(gè) 6K 蛋白（6K1)、柱狀內(nèi)含體蛋白（cylindrical inclusion protein, CI)、 第二個(gè)6K蛋白（6K2)、病毒的末端結(jié)合蛋白（Viral Protein Genome-linked，VPg)、核內(nèi)含 體 a 蛋白（Nuclear Inclusion a protein, NIa)、核內(nèi)含體 b 蛋白（Nuclear Inclusion b protein, Nib)和外殼蛋白（Coat Protein, CP) (Riechmann et al. , 1992 ；Urcuqui-Inchima et al.，2001)。另外，在P3基因內(nèi)部，在G2A7保守結(jié)構(gòu)域發(fā)生移碼，編碼一個(gè)新的蛋白，為 P3NPIP0(Chung et al. , 2008 ；ffei et al. , 2010 ；Vijayapalani et al. , 2012)〇
[0004] 植物病毒作為一種細(xì)胞內(nèi)專性寄生物，必須借助寄主的某些特異因子，才能在寄 主體內(nèi)建立侵染，完成翻譯、復(fù)制、運(yùn)動(dòng)等基本生命活動(dòng)（Charron et al.，2008)。植物病毒 在寄主體內(nèi)的翻譯是病毒完成系統(tǒng)性侵染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，在馬鈴薯Y病毒科病毒 翻譯的過程中，VPg起到關(guān)鍵作用。由于該類病毒基因組的端沒有帽子結(jié)構(gòu)m7GpppN(N 為任意核酸），病毒要完成翻譯，必須通過其編碼的VPg充當(dāng)帽子結(jié)構(gòu)與真核翻譯起始因子 (Eukaryotic translation initiation factor, elF)互作，形成四聚體并招募其他因子， 才能啟動(dòng)病毒 RNA 翻譯（Murphy et al.，1991，1996)。
[0005] 翻譯起始因子eIF4E是馬鈴薯Y病毒科病毒在寄主體內(nèi)啟動(dòng)翻譯的必須寄主因 子，長(zhǎng)期被病毒選擇利用，在病毒生命活動(dòng)中的功能具有相對(duì)的保守性和穩(wěn)定性，是病毒與 植物協(xié)同進(jìn)化的產(chǎn)物（Charron et al.，2008)，這類寄主因子基因突變產(chǎn)生的隱性抗病基 因具有廣譜性和持久性（Pavan et al.，2010)。隱性抗病基因在抗病毒植物中普遍存在， 因其對(duì)病毒的廣譜抗性，被廣泛應(yīng)用于作物抗病育種。最近10年，隨著病毒與寄主的互作 研究的深入，發(fā)現(xiàn)這些隱性抗病基因在生物學(xué)本質(zhì)上都是與病毒互作的寄主因子基因的突 變體，如辣椒中抗馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY)和煙草蝕刻病毒（Tobacco etch virus, TEV)的 pvr2、抗辣椒葉脈斑駁病毒（Pepper vein mottle virus, PVMY)的 pvr6,碗 豆中抗豌豆種傳花葉病毒（Pea seed-born mosaic virus, PSbMV)的sbml等，都是與病毒 互作的寄主翻譯起始因子基因eIF4El或eIF4E2的突變體。這種抗性非常持久，辣椒的抗 PVMY的pvr6使用了 50多年，依然有效。已經(jīng)報(bào)道的12個(gè)的對(duì)馬鈴薯Y病毒具有抗性的 隱性抗病基因，其中7個(gè)自然突變產(chǎn)生的，5個(gè)是通過T-DNA基因敲除等方法產(chǎn)生的，都是 翻譯起始因子基因的突變體（Robaglia&Caranta, 2006 ;Maule et al.，2007 ;Truniger et al. , 2009) 〇
[0006] 寄主隱性抗病基因的這種因失去與病毒互作能力而產(chǎn)生對(duì)病毒廣譜抗性的功能， 為利用RNAi技術(shù)開展廣譜抗病轉(zhuǎn)基因研究奠定了生物學(xué)基礎(chǔ)。利用RNAi技術(shù)，已經(jīng)成功 的沉默了擬南芥、西紅柿等植物的翻譯起始因子基因，獲得了具有廣譜抗性的突變體。擬南 芥AteIF4El基因突變時(shí)，產(chǎn)生了對(duì)苜蓿黃脈病毒（Clover yellow vein virus, C1YVV)的 抗性；AteIF4E2基因突變時(shí)，突變株產(chǎn)生了對(duì)蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus, TuMV)、 萬苣花葉病毒（Lettuce mosaic virus, LMV)和李痕病毒（Plum pox virus, PPV)的抗性 (Duprat et al.，2002 ;Sato, 2005 ;Decroocq et al.，2006)。在西紅柿中，沉默SleIF4El基 因，突變株同時(shí)免疫馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY)和辣椒斑駁病毒（P印per mottle virus，P印MoV)兩種病毒（Piron et al.，2010)，同時(shí)沉默番茄的 SleIF4El 和 SleIF4E2 基因，突變株產(chǎn)生的對(duì)PVY、TEV、辣椒斑駁病毒（P印per mottle virus，P印MoV)、彩葉 椒病毒（Ecuadorian rocotto virus, ERV)、辣椒重型花葉病毒（Pepper severe mosaic virus, PepSMV)、辣椒黃花葉病毒（Pepper yellow mosaic virus, PepYMV)及馬鈴薯 V 病毒 (Potato virus V，PVV)共7種病毒的抗性（Mazier et al.，2011)。特別值得注意的是，在 這些具有廣譜抗性的突變體中，都出現(xiàn)了表型沒有或基本沒有發(fā)生變化，能夠正常生長(zhǎng)發(fā) 育、完成生命周期的株系（Duprat et al.，2002 ;Sato, 2005 ;Decroocq et al.，2006 ;Piron et al. , 2010 ；Mazier et al.,2011)〇
[0007] 甘蔗花葉病病原主要由蚜蟲以非持續(xù)性方式傳播，通過常規(guī)手段難以防止?？够?葉病一直是甘蔗育種目標(biāo)之一，通過傳統(tǒng)的雜交方式，可以選育出抗花葉病的甘蔗品種。但 是，因?yàn)榛ㄆ诓挥?、?yōu)良基因型難以聚合、周期長(zhǎng)等原因，很難獲得高產(chǎn)高糖等農(nóng)藝性狀與 抗花葉病聚合的基因型。由病毒自身基因介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植株抗病性（pathogen-derived resistance，PDR) (Abel et al.，1986)的發(fā)現(xiàn)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，使利用生物工程手 段培育抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗成為可能。PDR的原理是RNAi，RNAi技術(shù)是在真核生物體內(nèi) 發(fā)生的、基于核酸序列同源性的一種基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。即雙鏈RNA (double-stranded RNA，dsRNA)被Dicer降解為21-26nt的小干擾RNA，而后者指導(dǎo)同源RNA進(jìn)行識(shí)別和切 害J，導(dǎo)致靶標(biāo)mRNA的降解，從而造成基因沉默。RNAi技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用與抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘 蔗材料的培育，但是其干擾對(duì)象主要是病毒的CP基因，由于CP基因多態(tài)性非常高，獲得 的轉(zhuǎn)基因材料僅對(duì)CP基因來源病毒株系免疫，對(duì)同一病毒的其他株系抗性不足或失去抗 性。J 〇yce(1998)將SCMV-E的外殼蛋白基因（CP)轉(zhuǎn)入甘蔗，隨機(jī)取田間發(fā)病甘蔗葉片 汁液（未明確病毒種類和株系）對(duì)突變體摩擦接種，突變體產(chǎn)生由抗到感一系列類型。 Ingelbrecht(1999)將 SrMV-H 株系的 CP 基因?qū)敫收?，?SrMV-H、SrMV-I、SrMV-M 和 SCMV-D對(duì)