一種提高葡萄糖氧化酶抗氧化性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是分子酶工程技術(shù)，特別是一種提高葡萄糖氧化酶抗氧化性的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄糖氧化酶G0D是氧化還原酶（El. 1. 3. 4)，它能專一性的將葡萄糖氧化為葡萄 糖酸和過氧化氫，根據(jù)反應(yīng)條件的不同，其反應(yīng)式如下：
[0003] 在沒有過氧化氫酶存在下，每摩爾葡萄糖氧化酶氧化時消耗1摩爾氧氣。
[0004] C6H1206+02- C 6H1207+H202
[0005] 在有過氧化氫酶存在下，每摩爾葡萄糖氧化酶氧化時消耗0. 5摩爾氧氣。
[0006] C6H1206+l/20 2-C 6H1207
[0007] 在有乙醇和過氧化氫酶同時存在下，過氧化氫同時被用于乙醇的氧化作用，此時， 每摩爾葡萄糖氧化酶氧化時消耗1摩爾氧氣。
[0008] C6H1206+C2H 50H+02- C 6H1207+CH3CH0+H20
[0009] 甲硫氨酸（Met)是構(gòu)成蛋白質(zhì)必需氨基酸的一種，為蛋白質(zhì)甲基化和轉(zhuǎn)硫化所必 需，甲硫氨酸易被氧化，它易受到過氧化氫、次氯酸鹽、羥基自由基的氧化而生成甲硫氨酸 亞砜，甲硫氨酸亞砜被進(jìn)一步氧化可形成甲硫氨酸砜。甲硫氨酸亞砜可以在特定條件下可 以還原為甲硫氨酸，而甲硫氨酸被氧化為甲硫氨酸砜在生物學(xué)是不可逆的。
[0010] H202被認(rèn)為是葡萄糖氧化酶G0D的競爭性抑制劑，其競爭性抑制的米氏常數(shù)和氧 氣對于葡萄糖氧化酶G0D的抑制的米氏常數(shù)幾乎一樣。同時，反應(yīng)產(chǎn)物H 202對葡萄糖氧化 酶中Met的氧化而使其活性降低或失活。如何提高突變葡萄糖氧化酶抗氧化性，使其在葡 萄糖氧化為葡萄糖酸的生產(chǎn)中提高生產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本，具有很大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是采用基因突變的方法，定點(diǎn)突變常規(guī)葡萄糖氧化酶，提高突變葡 萄糖氧化酶抗氧化性，使其在葡萄糖氧化為葡萄糖酸的生產(chǎn)中提高生產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。
[0012] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，通過計(jì)算機(jī)輔助分析設(shè)計(jì)，定點(diǎn)突變葡萄糖氧化酶（G0D) 特定位點(diǎn)甲硫氨酸，將甲硫氨酸替換為亮氨酸，并將其在畢赤酵母中表達(dá)，篩選出提高突變 葡萄糖氧化酶抗氧化性，使其在葡萄糖氧化為葡萄糖酸的生產(chǎn)中提高生產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成 本。
[0013] 1.計(jì)算機(jī)模擬分析葡萄糖氧化酶序列及分子對接
[0014] 通過對葡萄糖氧化酶序列分析（如圖1)，本發(fā)明涉及的G0D的黃素腺嘌呤二核 苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)結(jié)合區(qū)（下劃線標(biāo)示）對應(yīng)的氨基酸殘基為 16-54、239-306、529-553、560-583, FAD結(jié)合擴(kuò)展區(qū)（方框標(biāo)示）對應(yīng)的氨基酸殘基為Y68、 R230、C521，F(xiàn)AD覆蓋區(qū)（波浪線標(biāo)示）對應(yīng)的氨基酸殘基為76-96,黃素附著環(huán)（雙下劃線 標(biāo)示）對應(yīng)的氨基酸殘基為97-114。本實(shí)驗(yàn)后面設(shè)計(jì)氨基酸定點(diǎn)突變時都盡量避開這些結(jié) 合位點(diǎn)。
[0015] 在對葡萄糖氧化酶蛋白序列分析的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)葡萄糖氧化酶編碼基因的三個突 變體為G0D-8, G0D-M523L-M524L和G0D-M524L-M528L，通過計(jì)算機(jī)同源建模輔助分析三個 突變體結(jié)構(gòu)，將三個突變體分別與底物葡萄糖進(jìn)行分子對接（基于CD0CKER對接分析軟 件），以研究G0D突變后活性的影響。
[0016] 2.葡萄糖氧化酶及突變體表達(dá)載體的構(gòu)建
[0017] 通過全基因合成突變體G0D-8基因序列；并通過重疊延伸PCR擴(kuò)增 G0D-M523L-M524L、G0D-M524L-M528L突變體基因序列，具體如下：
[0018] G0D-M523L-M524L通過兩輪PCR擴(kuò)增，突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物為G0D-M1-F、G0D-M1-R、 GOD-F-EcoR I 和 GOD-R-Not I 〇
[0019] G0D-M524L-M528L通過兩輪PCR擴(kuò)增，突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物為G0D-M2-F、G0D-M1-R、 G0D-F-EcoR I 和 G0D-R-Not I 〇
[0020] 3.畢赤酵母中的表達(dá)、篩選及純化
[0021] 合成突變體基因后，通過分子克隆到PPIC9K載體上，重組表達(dá)載體用Sal I線性 化后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌株中，28°C培養(yǎng)3~4天，將MD平板上長出來的重組子，同 時轉(zhuǎn)接到MD和MM平板上，28°C溫箱培養(yǎng)48h。將顯色液（將10mL含1 %瓊脂糖的去離子 水加熱溶化，待冷卻到60°C以下，立即加入2mL18% D-葡萄糖，200 y L1 %溶于甲醇的鄰聯(lián) 茴香胺溶液和400 iiL 90U/mL辣根過氧化物酶、混勻，混合物即為顯色液）傾倒于待檢測 平板上，室溫靜置顯色，顯色30min后，根據(jù)顯色圈大小判斷G0D在畢赤酵母表達(dá)菌株中的 表達(dá)情況。將篩選得到表達(dá)活性較高的菌株于BMGY和BMMY培養(yǎng)基中搖瓶表達(dá)，搖瓶120h 后，收集發(fā)酵上清液。將發(fā)酵上清液在〇.〇5mM Tris-HCL(PH8.0)中透析去除鹽離子。經(jīng) Cellulose DE層析柱純化得到純酶樣品。
[0022]所述的 BMGY 培養(yǎng)基為：1 % Yeast extract，2 % peptone，1. 5 % Agar (固體），15 鎊（121 °C )滅菌 20min 后，加入 1. 34% YNB，4X 10 5% Biotin(過濾除菌），lOOmM lOOmM potassium phosphate(pH 6.0)Buffer pH6.0，l%Glycerol(過濾除菌）
[0023] 所述的 BMMY培養(yǎng)基為：1 % Yeast extract，2% peptone，1. 5% Agar (固體），15 鎊 (121°C )滅菌 20min 后，加入 1. 34% YNB，4X 10 5% Biotin(過濾除菌），lOOmM Potassium Phosphate (pH6. 0)，0? 5 % Methanol (過濾除菌）
[0024] 4.酶活性及酶蛋白含量的測定
[0025] G0D測酶活的原理：在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖和氧反應(yīng)，生成葡萄糖酸和 過氧化氫，過氧化氫和無色的還原型鄰聯(lián)茴香胺在過氧化物酶的作用下，生成水和紅色的 氧化型鄰聯(lián)茴香胺。
[0026]G0D酶活單位定義：在37°C，pH6. 0的條件下，1分鐘從1 y mol的0 -D-葡萄糖氧 化成D-葡萄糖酸和H202所需的酶量為一個葡萄糖氧化酶酶活力單位，以U/g(U/ml)表示。
[0027] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
[0028] 選用葡萄糖氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品，配制各種濃度葡萄糖氧化酶標(biāo)準(zhǔn)溶液。用磷酸鹽緩沖 液稀釋成 〇? 8U/mL，1. 2U/mL，1. 6U/mL，2. 0U/mL，2. 4U/mL，2. 8U/mL。取 10ml 試管中，加入 2. 5ml鄰聯(lián)茴香胺，0. 3ml葡萄糖溶液，0. lml過氧化氫酶溶液組成反應(yīng)體系，反應(yīng)體系在 37°C保溫5min后，分別加入各種濃度葡萄糖氧化酶標(biāo)準(zhǔn)溶液0. lmL，反應(yīng)3min后，加入2M H2S04(濃硫酸：水v/v = l:8)2mL，振蕩搖勾以終止反應(yīng)，利用分光光度計(jì)540nm波長測定吸 光值。
[0029] 以葡萄糖氧化酶濃度為Y軸、吸光度0D值為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0030] 測定步驟：吸取適當(dāng)稀釋的酶液（根據(jù)具體濃度確定稀釋倍數(shù)），按上開始操作。 利用葡萄糖氧化酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算試驗(yàn)樣品中葡萄糖氧化酶的濃度。
[0031] 試樣酶活力的計(jì)算：
[0032] Y= [K(AE-AB)+C0] XD
[0033] Y-試樣稀釋液中的葡萄糖氧化酶活力，U/mL ;AE-酶反應(yīng)液的吸光度；
[0034] AB-酶空白樣的吸光度；K 一標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；
[0035] C0-標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；D-試樣的總稀釋倍數(shù)。
[0036] 本發(fā)明采用Bradford法測蛋白質(zhì)濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將標(biāo)準(zhǔn)蛋白液稀釋成 10 y g/ml、20 y g/ml、40 y g/ml、60 y g/ml、80 y g/ml 及 100 y g/ml 的蛋白濃度梯度溶液，分 別取lml放入10ml試管中，每管加入5ml考馬斯亮藍(lán)試劑，混勾，靜止5min，于595nm測定 其吸光度，以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0037] 可溶蛋白的測定：取1ml待測樣品放入10ml試管中，每管加入5ml考馬斯亮藍(lán)試 劑，混勾，靜止5min，于595nm測定