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      一種密碼子優(yōu)化的磷酸膽堿胞苷轉移酶的基因及其表達的制作方法

      文檔序號:9320588閱讀:978來源:國知局
      一種密碼子優(yōu)化的磷酸膽堿胞苷轉移酶的基因及其表達的制作方法
      【技術領域】
      [0001] 本發(fā)明屬微生物技術領域,具體涉及一種按大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化的磷酸膽堿 胞苷轉移酶(Cholinephosphate cytidylyltransferase,EC 2. 7. 7. 15, CCT)的基因及 其表達。
      【背景技術】
      [0002] 胞磷膽堿(cytidine-5'-diphosphate choline)是一種重要的核酸衍生物,是卵 磷脂生物合成的主要輔酶,能夠促進腦細胞呼吸,恢復神經組織功能,改善腦代謝和循環(huán), 可用于治療腦血管病、帕金森氏綜合癥、抑郁癥,對于治療顱腦損傷和腦血管意外所導致的 神經系統(tǒng)疾病具有明顯的療效。其對延緩衰老,提高學習效果和記憶力等也有一定的療效, 因此在臨床上得到廣泛的應用。
      [0003] 關于胞磷膽堿合成的報道較多,主要包括化學合成、生物合成方法制備?;瘜W合成 通常需要先制備一些中間體,工藝繁瑣且生產成本過高,其操作要求嚴格,轉化率也不高。
      [0004] 生物合成方法利用磷酸膽堿酸轉移酶(CCT酶)在溫和的條件下,直接催化胞苷三 磷酸(CTP)和磷酸膽堿合成胞磷膽堿。生物合成轉化率高、成本低且操作簡便。因此,近年 胞磷膽堿的生產大多都集中在生物合成。
      [0005] 作為參與胞磷膽堿生物合成反應的微生物需具有高活性的CCT酶,而微生物細 胞中CCT酶的活性普遍較低,CCT酶就成了控制CDP-膽堿合成的限速酶。
      [0006] 偏愛密碼子的使用能夠較大幅度提高基因的表達水平。本發(fā)明按照大腸桿菌偏愛 密碼子優(yōu)化釀酒酵母磷酸膽堿胞苷轉移酶基因并構建高效表達菌株,若該菌用于工業(yè)化生 產,能極大提高工業(yè)產值并為企業(yè)帶來顯著經濟效益。

      【發(fā)明內容】

      [0007] 本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種按大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化的磷酸膽 堿胞苷轉移酶cct基因。
      [0008] 本發(fā)明還要解決的問題是提供上述基因的表達。
      [0009] 為了解決上述技術問題,本發(fā)明采用以下技術方案來實現(xiàn)。
      [0010] -種按大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化的磷酸膽堿胞苷轉移酶基因(cd基因),其核苷 酸序列SEQ ID N0:1所示。
      [0011] 本發(fā)明按照大腸桿菌的密碼子偏好性對野生型cc湛因進行改造,改造后的基因 序列與野生型序列同源性為76. 6% (圖1),其編碼的蛋白質共424個氨基酸,氨基酸序列如 SEQ ID N0 : 2 所示。
      [0012] 本發(fā)明中經密碼子優(yōu)化磷酸膽堿胞苷轉移酶cct基因委托南京拓達生物科技有 限公司進行全基因合成,基因合成服務中使用PUC57質粒作為亞克隆載體。
      [0013] -種重組載體,它含有權利要求1所述的核苷酸序列,如SEQ ID N0 : 1所示。
      [0014] 一種重組菌,它含有權利要求4或5所述的重組載體。
      [0015] 上述重組菌的構建方法,cd基因由全基因合成,將cd基因偏好序列插入 pET29a (+)的多克隆位點處得到的重組質粒,所述表達載體中啟動所述DNA轉錄的啟動子 為T7啟動子。再將重組質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中。具體方法是: 合成全基因序列時,分別在5'和3'端引入Nde I和Xho I酶切位點,將質粒pUC57-Cct-〇p 雙酶切,回收cct-op片段,將cct-op片段用T4 DNA連接酶連接到pET-29a (+)載體相應的 酶切位點上,通過酶切鑒定及測序驗證獲得了重組質粒pET-29a-cct-〇p。采用化學轉化的 方法將重組質粒pET-29a-cct-〇p轉化到大腸桿菌BL21(DE3)和Rosetta (DE3)中,獲得重 組菌。
      [0016] 上述重組菌的表達方法,培養(yǎng)重組菌至0D6。。為0.6-0. 8時添加終濃度0.2 - ImM 的 IPTG,在 28°C,220 rpm 條件下誘導 10 - 24h。
      [0017] 獲得重組菌細胞粗酶液,粗酶液的反應條件為:1 mL終濃度為150 mmol/L磷 酸鉀緩沖液(pH 7. 5)、25 mmol/L氯化鎂、10 mmol/L CTP、20 mmol/L磷酸膽堿及粗酶 液組成的反應液,30 °C反應2 h。定時0. 5 h取樣,每次取50 yL反應液,添加50 yL 0. 2 mmol / L醋酸后,通過在100 °C加熱處理2 min中止反應。冷卻后將該處理物12 000 r/min離心10 min,用適量的蒸餾水稀釋上清液,用高效液體色譜(HPLC)定量生成 的CDP-膽堿。
      [0018] 本發(fā)明按照大腸桿菌的密碼子偏好性優(yōu)化了來源于釀酒酵母的原始的cc湛因, 改造后的基因序列與原序列同源性為76. 6% (參見圖1),其編碼的蛋白質含424個氨基酸 與野生型序列一致,密碼子優(yōu)化后的cc湛因轉化如大腸桿菌后表現(xiàn)出較高的酶活。
      [0019] 本發(fā)明的優(yōu)點在于使用大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化的cct基因的編碼序列來制備 表達質粒,優(yōu)化后的^湛因與野生基因的同源性為76. 6%,表現(xiàn)出較高的粗酶液酶活,可 應用于磷酸膽堿的合成。
      【附圖說明】
      [0020] 圖1為密碼子優(yōu)化的磷酸膽堿胞苷轉移酶CC湛因構建圖。
      [0021] 圖2為本發(fā)明優(yōu)化的磷酸膽堿胞苷轉移酶湛因和原始釀酒酵母磷酸膽堿胞 苷轉移酶cc湛因的序列比對圖。
      [0022] 圖3為密碼子優(yōu)化前后的mRNA二級結構對比。其中,a為密碼子優(yōu)化前,b為密 碼子優(yōu)化后。
      【具體實施方式】
      [0023] 下面結合【具體實施方式】來進一步闡述本發(fā)明。
      [0024] 本發(fā)明實施中未注明的實驗方法,如連接、轉化、相關培養(yǎng)基的配制等參照分子克 隆實驗指南第三版中方法進行。分子試劑購自大連Takara公司,未注明的化學藥品為分析 純級,購自上海國藥集團有限公司。
      [0025] 實施例1重組大腸桿菌的構建。
      [0026] 1. 1密碼子優(yōu)化磷酸膽堿胞苷轉移酶基因的密碼子優(yōu)化及全基因合成。
      [0027] 本發(fā)明根據(jù)來源于釀酒酵母磷酸膽堿胞苷轉移酶cciS因序列,采取全基因合成 的方法按照大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化的磷酸膽堿胞苷轉移酶基因,委托南京拓達生物科 技有限公司合成,基因合成服務中使用PUC57質粒作為亞克隆載體,用于磷酸膽堿胞苷轉 移酶基因大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化合成的磷酸膽堿胞苷轉移酶基因的開放閱讀框為1275 個堿基。通過Vector NTI軟件進行同源性比對,結果發(fā)現(xiàn)該合成序列與原序列同源性為 76.6% (參見圖1),其編碼的蛋白質共424個氨基酸。用DNAstar對優(yōu)化前后的cc湛因 的mRNA二級結構進行預測,結果顯示優(yōu)化后的mRNA二級結構比優(yōu)化前簡單(見圖3),配對 堿基數(shù)從364減少到333個,莖的結構從87減少到79個,有利于蛋白翻譯過程中核糖體與 mRNA的結合和快速翻譯。
      [0028] 優(yōu)化后的磷酸膽堿胞苷轉移酶基因序列為南京拓達生物科技有限公司合成,質粒 命名為 pUC57_cct_op。
      [0029] 1. 2 帶有質粒 pET-29a_cct-〇p 的大腸桿菌 BL21 (DE3)和 Rosetta (DE3)的構建。
      [0030] 將基因合成的pUC57-Cc
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