用于生物合成白藜蘆醇的融合基因、表達(dá)載體及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種用于生物合成白藜蘆醇的融合基因、蛋白、表達(dá)載體及應(yīng)用，具體 屬于基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 白藜蘆醇是植物在受到外界逆境刺激時產(chǎn)生的一種植物保護(hù)素，常見的植物生長 逆境有紫外線輻射、真菌感染以及機械損傷等，而白藜蘆醇是少數(shù)幾種高等植物受到真菌 感染、損傷及紫外線輻射時產(chǎn)生的一種植保素，是一種非常重要的次級代謝產(chǎn)物。作為紅葡 萄酒的有效成分，它可預(yù)防多種疾病，如抗凝血、抗氧化、抗炎免疫、抗癌、心血管保護(hù)和神 經(jīng)保護(hù)等作用。因此，白藜蘆醇被譽為繼紫杉醇之后又一新的綠色抗癌藥物。然而，一般植 物中白藜蘆醇的含量都比較低，難以滿足市場的需求。生物合成白藜蘆醇是目前的研究熱 點，該法不僅可以克服植提法所面臨的生態(tài)破壞與資源匱乏問題，也可以解決化學(xué)合成法 所帶來的環(huán)境污染問題。
[0003] 融合基因技術(shù)是將兩個或多個表達(dá)不同功能蛋白的基因通過分子生物學(xué)的手段 連接起來，從而能夠編碼出具有多個功能的復(fù)合蛋白。在每個蛋白之間都需要一個起過渡 連接作用的柔性氨基酸鏈（1 inker)，這樣使得最終得到的融合蛋白不僅具有所有蛋白酶的 活性，而且還能夠增加總酶促反應(yīng)速率。研究表明，在構(gòu)建融合基因時，首先應(yīng)該刪除上游 基因的終止密碼子與下游基因的起始密碼子，這樣才能實現(xiàn)兩個基因的融合表達(dá)?；蛉?合技術(shù)在微生物合成白藜蘆醇的過程中，對于提高產(chǎn)率具有較好的指導(dǎo)意義。
[0004] 近10年來，生物合成白藜蘆醇一直是科學(xué)界的研究熱點，該方法不僅可以克服植 提法所面臨的生態(tài)破壞與資源匱乏等問題，也可以解決化學(xué)合成法所帶來的環(huán)境污染問 題。目前，國內(nèi)很多研究學(xué)者對白藜蘆醇合酶基因（RS)研究的比較深入，但是他們研究主 要局限在將該基因轉(zhuǎn)化到目標(biāo)植物，對于將該基因轉(zhuǎn)化到微生物中仍然面臨著微生物表達(dá) 不穩(wěn)定以及目標(biāo)產(chǎn)物得率比較低等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于生物合成白藜蘆醇的融合基因、蛋白、表達(dá)載體。
[0006] 另一目的是提供一種用于生物合成白藜蘆醇的融合基因的制備及表達(dá)方法。
[0007]另一目的是提供一種利用重組菌株發(fā)酵制備白藜蘆醇的方法。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用技術(shù)方案如下：
[0009] -種用于生物合成白藜蘆醇的融合基因，它是由擬南芥的對香豆酰輔酶A連接酶 基因與花生的白藜蘆醇合酶基因融合得到的4CL: :RS融合基因，是SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列。測序結(jié)果表明，4CL : :RS融合基因全長為2895bp，包括去除終止密碼子的4CL 基因片段（1693bp)、去除起始密碼子的RS基因片段（1167bp)以及柔性linker的45個核 苷酸，與原設(shè)計一致。DNAMAN軟件分析構(gòu)建的4CL : :RS融合基因的核苷酸序列及其編碼的 氨基酸序，加框的ATG為4CL : :RS融合基因的起始密碼子，中間45個加框序列為linker 的核苷酸序列，下劃線序列CCATGG，GGATCC，GAATTC分別代表著Nco I、BamH I和EcoR I酶 切位點。
[0010] 用于生物合成白藜蘆醇的融合基因編碼的蛋白質(zhì)，它是SEQ ID No. 2所示的氨基 酸序列。分析表明4CL::RS融合基因共編碼964個氨基酸，分子量（Mr)為104. 7kDa，pi 為 5. 63。
[0011] 含有上述融合基因的表達(dá)載體pET-30a/4CL: :RS。
[0012] 前述融合基因的制備及表達(dá)方法，具體為：首先在大腸桿菌中克隆擬南芥4CL基 因與花生RS基因，通過基因融合技術(shù)將4CL基因與花生RS基因融合起來，選擇大腸桿菌作 為宿主菌株，實現(xiàn)4CL : :RS融合基因在原核中的表達(dá)；所述的基因融合技術(shù)采用的是長度 為15個氨基酸的柔性Linker，其氨基酸序列為（GGGGS) 3，并將其對應(yīng)的核苷酸序列設(shè)計為 ggt gga ggc RRa tcc ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg，戶斤述劃線序列為BamH I酶切位點，通過多步PCR反應(yīng)、BamH I單酶切反應(yīng)以及連接反應(yīng)，構(gòu)建融合基因4CL:: RS，隨后，通過Nco I與EcoR I酶切位點構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30a/4CL : :RS，在28°C誘 導(dǎo)表達(dá)8h，分別通過Proteinlso? Ni-NTA Resin純化及Western blot分析驗證所構(gòu)建的 原核表達(dá)載體pET-30a/4CL : :RS能夠表達(dá)目的融合基因4CL : :RS，即所得到的重組菌株 BL21 (DE3)攜帶重組質(zhì)粒 pET-30a/4CL::RS。
[0013] 所采用的引物分成兩條設(shè)計，4CL: :RS-FJP4CL: AS-Ri為第一個基因4CL的 上、下游引物，4CL: :RS-F#引入了 Nco I酶切位點CCA TGG，4CL: AS-Ri在引入BamH I 酶切位點的同時又將4CL基因的終止密碼子TAG敲除；4CL : :RS-F21、4CL : :RS-F22、4CL :: RS-R2為第二個基因（RS)的上、下游引物引物，4CL : : RS-F 22在引入BamH I酶切位點的同 時又將RS基因的起始密碼子ATG敲除，在下游引物4CL : :RS-R2*引入酶切位點EcoR I。
[0014] 利用前述重組菌株發(fā)酵制備白藜蘆醇的方法，包括以下步驟：
[0015](一）重組菌株的活化
[0016] (1)將-80°c保存的重組菌株的甘油菌放置在38°C~40°C水浴中，不斷搖動直至 全部融化成液狀；
[0017] (2)無菌條件下，用接種環(huán)將少量融化的菌種劃線在含有硫酸卡鈉霉素的平板 上；
[0018] (3)將劃線后的平板密封后，37°C條件下靜置15min，最后將其在37°C的恒溫培養(yǎng) 箱中倒置培養(yǎng)12h后觀察菌落；
[0019](4)無菌條件下，挑取平板上的單菌落至lmL的LB體培養(yǎng)基，在37°C，200rpm條件 下過夜培養(yǎng)；
[0020] (二）發(fā)酵轉(zhuǎn)化及其產(chǎn)物的提取
[0021] (1)無菌條件下，將500 y L活化后的重組菌液按1 : 50的接種比例接種至50mL 新鮮且預(yù)熱的LB培養(yǎng)基；
[0022] (2) 37°C，200rpm的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，培養(yǎng)基中發(fā)酵菌液的0D6。。值為0. 2 ;
[0023] (3)在200 y L DMS0中溶解0? 00821g的對香豆酸，搖勻充分溶解；
[0024] (4)在無菌條件下，將上述配置的對香豆酸溶液全部加入到發(fā)酵菌液中，此時對香 豆酸的終濃度為ImM ;
[0025](5) 28 °C，200rpm的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)48h;
[0026] (6)充分搖勻發(fā)酵液，無菌條件下取lmL發(fā)酵液放置于1.5mL的離心管中， 13000rpm 離心 3min;
[0027] (7)將上清液轉(zhuǎn)至新的離心管中并添加50 y L的0. lmol/1的HC1，-20°C冷凍過 夜；
[0028] (8)室溫條件下，將冷凍離心管緩慢解凍并加入lmL的乙酸乙酯萃取，重復(fù)3次；
[0029] (9)萃取結(jié)束后，將乙酸乙酯相合并并用氮吹儀將其吹干；
[0030] (10)最后將所得殘留成分溶解于lmL的色譜甲醇中，進(jìn)樣前置于-20°C保存。
[0031] (三）產(chǎn)物檢測
[0032] 將步驟（二）得到的產(chǎn)物經(jīng)過高效液相色譜檢測及紫外吸收檢測，與白藜蘆醇標(biāo) 品的色譜圖和紫外吸收圖進(jìn)行比較，洗脫時間為13min左右時有一個明顯的色譜峰，該色 譜峰的洗脫時間和對應(yīng)的紫外吸收波長通過與白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)品相對比，證實了發(fā)酵產(chǎn)物 中含有白藜蘆醇。
[0033] 本發(fā)明的有益效果是：
[0034] (1)根據(jù)引物設(shè)計原則，若將linker核酸序列中BamH I酶切位點后的序列都設(shè)計 到第二個基因（RS)的上游引物中，會使得此條引物的長度高達(dá)63bp，這樣會大大降低引物 特異性，因此本發(fā)明將此條引物分成兩條設(shè)計：4CL : :RS-FJP 4CL : :RS-R i為第一個基因 (4CL)的上、下游引物，4CL: :RS-F#引入了 Nco I 酶切位點（CCA TGG)，4CL: :RS-R^ 引入BamH I酶切位點的同時又將4CL基因的終止密碼子TAG敲除；4CL : :RS-F21、4CL :: RS-F22、4CL: :RS-R2為第二個基因（RS)的上、下游引物引物，4CL: :RS-F22在引入BamH I 酶切位點的同時又將RS基因的起始密碼子ATG敲除，在下游引物4CL : :RS-R2中引入酶切 位點EcoR I(GAA TTC)，這樣大大降低了引物的特異性。
[0035] (2)本發(fā)明成功構(gòu)建了重組菌，并且對發(fā)酵工藝條件如培養(yǎng)及種類、添加底物濃 度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間以及誘導(dǎo)劑濃度等方面進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，使得目標(biāo)產(chǎn)物白藜蘆醇的 產(chǎn)量和摩爾轉(zhuǎn)化率都較高。
【附圖說明】
[0036] 圖1是本發(fā)明擬南芥4CL基因擴增程序不意圖。
[0037] 圖2是本發(fā)明菌液PCR反應(yīng)程序示意圖。
[0038] 圖3是本發(fā)明4CL::RS基因片段I的PCR擴增程序示意圖。
[0039] 圖4是本發(fā)明4CL::RS基因片段II的PCR擴增程序示意圖。
[0040] 圖5是本發(fā)明4CL: :RS基因PCR擴增程序示意圖。
[0041] 圖6是本發(fā)明基因片段I、基因片段II與4CL: :RS的電泳圖。
[0042]其中，M :BM5000Marker ;1-2:基因片段 I ;3-4:基因片段 II ;5-6 :4CL::RS
[0043] 圖7是本發(fā)明pET_30a/4CL::RS的菌液PCR鑒定電泳圖。
[0044] 其中，M :BM5000Marker;1-6:陽性菌擴增片段；7:陰性對照；8:陽性對照
[0045] 圖8是本發(fā)明pET_30a/4CL: :RS的酶切鑒定電泳圖。
[0046] 其中，M:蛋白分子量Marker ;1:未純化蛋白；2 :Ni_NTA純化蛋白
[0047] 圖9是本發(fā)明4CL: :RS融合蛋白SDS-PAGE電泳圖。
[0048]其中，M:蛋白分子量Marker ;1:未純化蛋白；2 :Ni_NTA純化蛋白
[0049] 圖10是本發(fā)明融合蛋白4CL::RS的Western blot分析圖。
[0050]其中，1 :5yL樣品；2 :10yL樣品；3 :15yL樣品；4 :20yL樣品
[0051]圖11是本發(fā)明白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0052]圖12a為本發(fā)明白藜蘆醇標(biāo)品的色譜圖。
[0053] 圖12b為本發(fā)明重組菌發(fā)酵產(chǎn)物色譜圖。
[0054]圖13a為本發(fā)明白藜蘆醇標(biāo)品紫外吸收圖。
[0055]圖13b為本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物的紫外吸收圖。
【具體實施方式】
[0056] 如果沒有特別說明，本發(fā)明所采用的各種藥品、試劑等均能從市場上獲得，對于不 能夠直接購買的菌株或質(zhì)粒，都能夠按照現(xiàn)有技術(shù)給出的方法制備而得。
[0057] 實施例1 4CL :