重組質(zhì)粒、重組病毒載體、重組病毒毒株及其應(yīng)用、重組蛋白及含有該蛋白的亞單位疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物基因工程與動(dòng)物病毒學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及重組質(zhì)粒、重組病毒 載體、重組病毒毒株及其應(yīng)用、重組蛋白及含有該蛋白的亞單位疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)是一種嚴(yán)重危害豬群的病毒病。主要特征表現(xiàn)母豬 繁殖障礙及育肥豬和小豬呼吸困難。GP5是PRRSV重要的糖蛋白，能夠誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生及 免疫保護(hù)。因此作為研究對(duì)抗PRRS的基因工程疫苗的主要靶位點(diǎn)。雖然滅活和修飾后的 活疫苗可以利用，但是其保護(hù)性不再完整。因此為了研究對(duì)抗PRRSV感染的有效疫苗，須發(fā) 展一種新的技術(shù)。
[0003] 作為RNA病毒，PRRSV的基因在合成時(shí)容易出現(xiàn)內(nèi)在性錯(cuò)誤，滅活疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免 疫的能力較弱，產(chǎn)生的保護(hù)作用較短，藍(lán)耳病還存在"抗體依賴性增強(qiáng)作用"。因此用于發(fā) 展預(yù)防PRRS的滅活疫苗和弱毒疫苗都存在一定的弊端?；诖?，利用基因工程方法研制 PRRSV的亞單位疫苗具有更好的免疫原性，將成為防治該病的重要方向。因此，該亞單位疫 苗在豬藍(lán)耳病的防制方面將具有很廣泛的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明提供重組質(zhì)粒、重組病毒載體、重組病毒毒株及其應(yīng)用、重組蛋 白及含有該蛋白的亞單位疫苗。該重組病毒毒株高效表達(dá)豬藍(lán)耳病病毒GP5蛋白，使其具 有更好的免疫原性，并且制得了免疫效果好的亞單位疫苗。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒，由具有如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的PRRSV GP5 基因片段與質(zhì)粒載體重組構(gòu)建而成。
[0007] 根據(jù)PRRSV GP5基因序列，利用PCR擴(kuò)增結(jié)合DNA拼接、克隆的方法（參見：J.薩 姆布魯克等，王嘉等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版），科學(xué)出版社，2002年版）對(duì)0RF基因 進(jìn)行修飾，通過(guò)PCR方法去除GP5基因其N端信號(hào)肽的31個(gè)氨基酸。將GP5基因插入到桿 狀病毒表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。引物A1(如SEQ ID No. 5所示核苷酸序列）、A2(如 SEQ ID No. 6所示核苷酸序列）用于擴(kuò)增GP64編碼的序列；引物B1(如SEQ ID No. 7所示 核苷酸序列）、B2(如SEQ ID No. 8所示核苷酸序列）用于擴(kuò)增GP64 TM-CTD編碼的序列； 引物C1(如SEQ ID No. 2所示核苷酸序列）、C2(如SEQ ID No. 3所示核苷酸序列）用于擴(kuò) 增PRRSV-0RF5基因，獲得目的片段。
[0008] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，重組質(zhì)粒中所述PRRSV GP5基因片段的擴(kuò)增引 物組由如SEQIDNo. 2所示核苷酸序列的上游引物和如SEQIDNo. 3所示核苷酸序列的下 游引物組成。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種重組病毒載體，其由具有如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的 PRRSV GP5基因片段與病毒載體重組構(gòu)建而成。
[0010] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，重組病毒載體中所述PRRSV GP5基因片段的擴(kuò) 增引物組由如SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的上游引物和如SEQ ID No. 3所示核苷酸序列 的下游引物組成。
[0011] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，重組病毒載體中所述病毒載體為昆蟲桿狀病毒 表達(dá)質(zhì)粒載體。
[0012] 在本發(fā)明中，構(gòu)建了一種新型的pBacSC載體。編碼gp64 SS，HIS6的序列、多克隆 位點(diǎn)（BssH II，Nco I位，NHE位和Sph I位）集中在HIS6與桿狀病毒gp64 CTD之間，桿狀 病毒細(xì)胞進(jìn)入是通過(guò)gp64蛋白介導(dǎo)，在宿主細(xì)胞表達(dá)后，gp64蛋白SS直接穿過(guò)細(xì)胞膜，并 以三聚體的形式出現(xiàn)于受感染細(xì)胞表面，該融合蛋白的表達(dá)與本體的糖蛋白gp64啟動(dòng)后， 轉(zhuǎn)入質(zhì)膜，進(jìn)入桿狀病毒包膜內(nèi)。以假型桿狀病毒作為一個(gè)潛在的疫苗傳遞系統(tǒng)的方法已 被廣泛使用。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種重組病毒毒株，由本發(fā)明提供的上述重組病毒載體經(jīng)包裝細(xì) 胞包裝而成。
[0014] 本發(fā)明首先擴(kuò)增PRRSV-0RF5基因，獲得507bp目的基因片段（如SEQ ID No. 1所 示核苷酸序列），將其與昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體質(zhì)粒連接，通過(guò)酶切反應(yīng)鑒定及序列分析得 到重組表達(dá)質(zhì)粒；測(cè)序表明，擴(kuò)增得到507bp的PRRSV-0RF5基因，與已發(fā)表的PCV2序列同 源性達(dá)到97%以上，表明該基因具有很高的保守性。將所得到的重組表達(dá)質(zhì)粒與線性化桿 狀病毒DNA共浴，加入細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑，取轉(zhuǎn)感細(xì)胞培養(yǎng)上清做蝕斑克隆與篩選試驗(yàn)，采用病 毒培養(yǎng)物上清，接種昆蟲細(xì)胞，篩選獲得一株穩(wěn)定、高效表達(dá)PRRSV-GP5蛋白的重組桿狀病 毒毒株（BacSC-Dual-GP5)。
[0015] 本發(fā)明提供的病毒株的生物保藏編號(hào)為CGMCC No. 2467或CGMCC No. 2657。
[0016] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，包裝細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞，優(yōu)選為sf-9細(xì)胞。
[0017] 本發(fā)明還提供了上述重組桿狀病毒毒株在制備預(yù)防和/或治療PRRSV感染相關(guān)疾 病的藥物制劑的應(yīng)用。
[0018] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述重組桿狀病毒毒株在制備預(yù)防和/或治療 PRRSV感染相關(guān)疾病的藥物制劑應(yīng)用中，所述PRRSV感染相關(guān)疾病為豬繁殖與呼吸綜合征。
[0019] 本發(fā)明還提供了上述重組病毒毒株表達(dá)的重組蛋白。
[0020] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0021] 本發(fā)明重組毒株所表達(dá)的重組蛋白除去融合部分，其產(chǎn)物表達(dá)產(chǎn)量比未用桿狀病 毒做載體的高30%。由于本發(fā)明在重組蛋白的C末端設(shè)計(jì)了 His-6序列，該序列具有強(qiáng)烈 的親和作用，該序列被加在表達(dá)的蛋白的兩端，容易在親和層析柱中洗脫下來(lái)，達(dá)到較好的 分離效果。為下一步重組蛋白的純化奠定了基礎(chǔ)。
[0022] 該重組毒株可以在昆蟲細(xì)胞高效表達(dá)重組PRRSV-GP5蛋白，所表達(dá)的重組 PRRSV-GP5蛋白具有良好的免疫反應(yīng)活性，可作為豬藍(lán)耳病病毒亞單位疫苗。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種亞單位疫苗，其包含：
[0024] (I)如上述重組病毒毒株表達(dá)的重組蛋白或與其同源性達(dá)80%以上的蛋白；
[0025] 和 / 或
[0026] (II)如上述重組蛋白或與其同源性達(dá)80%以上的蛋白。
[0027] 本發(fā)明構(gòu)建了一種高效表達(dá)豬藍(lán)耳病病毒GP5蛋白的重組桿狀病毒毒株 BacSC-Dual-GP5,使其具有更好的免疫原性。本發(fā)明重組毒株所表達(dá)的重組蛋白除去融合 部分，其產(chǎn)物表達(dá)產(chǎn)量非常高。此外，本發(fā)明在重組蛋白的C末端設(shè)計(jì)了 His-6序列，該序 列具有強(qiáng)烈的親和作用，被加在表達(dá)蛋白的兩端，容易在親和層析柱中洗脫下來(lái)，達(dá)到較好 的分離效果，為下一步重組蛋白純化奠定基礎(chǔ)。用研制的PRRSV-GP5亞單位疫苗制品對(duì)本 動(dòng)物是安全的。疫苗免疫效力試驗(yàn)結(jié)果表明，所有疫苗免疫后28天抗體檢測(cè)全部轉(zhuǎn)陽(yáng)；強(qiáng) 毒攻擊試驗(yàn)結(jié)果表明，lml和2ml免疫組均獲得100 %保護(hù)，0. 5ml組獲得80% (4/5)保護(hù)。
[0028] 生物保藏說(shuō)明
[0029] 重組桿狀病毒BacSC-Dual-GP5。保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 2467〇
【附圖說(shuō)明】
[0030] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0031] 圖1示藍(lán)白斑篩選重組桿狀病毒的結(jié)果；其中，圖1(A)示野生型桿狀病毒包涵體； 圖1 (B)示重組型桿狀病毒（藍(lán)斑）；
[0032] 圖2示重組毒株感染sf-9細(xì)胞后形成的病毒包涵體；其中，E示野生型桿狀病毒 包涵體；F示重組桿狀病毒包涵體；
[0033] 圖3示重組PRRSV-GP5蛋白用親和層析柱純化結(jié)果；其中，M :蛋白分子量標(biāo)記物； L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8 分別為：96h、72h、60h、48h、36h、24h、12h、6h 的表達(dá)產(chǎn)物結(jié)果；
[0034] 圖4示表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析結(jié)果；
[0035] 圖5示本發(fā)明獲得的重組質(zhì)粒圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 本發(fā)明公開了重組質(zhì)粒、重組病毒載體、重組病毒毒株及其應(yīng)用、重組蛋白及含有 該蛋白的亞單位疫苗，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需 要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，它們都被視為 包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在 不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合， 來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0037] 本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒、重組病毒載體、重組病毒毒株及其應(yīng)用、重組蛋白及含有 該蛋白的亞單位疫苗中所用原料及試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。
[0038] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0039] 實(shí)施例1 :本發(fā)明重組桿狀病毒（BacSC-Dual_GP5)的構(gòu)建和重組蛋白的表達(dá)
[0040] 1材料與方法
[0041] 1. 1病毒、細(xì)胞及抗血清
[0042] 豬繁殖與呼吸綜合征病毒毒株：系由吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院傳染病教研室丁壯教 授贈(zèng)送。細(xì)胞培養(yǎng)采用01^11培養(yǎng)液，添加8-12%胎牛血清和1001]/1111青霉素及100 1^/1111 鏈霉素。按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，接種病毒當(dāng)Marc-145細(xì)胞長(zhǎng)到培養(yǎng)表面單層75-80% 時(shí)，細(xì)胞傳代效果好（蘭海楠，趙小麗，et al.豬藍(lán)耳病CH-IR株（PRRSV-CH-IR)在侯腎細(xì) 胞（marc-145)中的培養(yǎng)[J].動(dòng)物傳染病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生，2008. 231-234)。利用Grace氏 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基和昆蟲sf-9細(xì)胞在27°C環(huán)境中培養(yǎng)桿狀病毒載體，同時(shí)添加胎牛血清、同 時(shí)添加10 %、l〇〇U/ml青霉素及100 y g/ml鏈霉素。
[0043] 1. 2重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0044] PRRSV-0RF5基因序列擴(kuò)增：取100 y 1病毒培養(yǎng)物，加入2 y 1蛋白酶K(20mg/ml) 于37°C消化2h，經(jīng)水浴煮沸5min，12000r/min離心10min，取上清用于DNA擴(kuò)增。引物A1 (如 SEQ ID No. 5所示核苷