量分析（參考文獻(xiàn)：Kato, M.，Bao, H. J.，Kang，C. K. , Fukui, T. , Doi, Y. , 1996. Production of a novel copolyester of3-hydroxybutyric acid and medium chain length 3-hydroxyalkanaic acids by Pseudomonas sp 61_3from sugars. Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 363-370.) D 運(yùn)用核磁共振譜儀 NMR(JE0L， ECA-600SCC)對實(shí)驗(yàn)得到的聚合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。
[0167] 氣相檢測3-羥基丙酸與3-羥基丁酸共聚物的方法：
[0168] 設(shè)定爐溫為80°C，進(jìn)樣器溫度為240°C，檢測器溫度為250 °C，柱頭壓力為 0. 25Mpa，程序升溫條件為：80°C停留1. 5分鐘，以30°C /min的速度升溫至140°C，接著以 40°C /min的速度升溫至240°C并在此溫度保持0. 5分鐘。樣品的進(jìn)樣量為1 y 1，使用島津 公司生產(chǎn)的自動進(jìn)樣器。
[0169] 氣相樣品準(zhǔn)備：取40-60mg待測樣品的干細(xì)胞（菌液lOOOOrpm，10分鐘條件下離 心，所得細(xì)胞沉淀水洗一次之后，冰干，得到干細(xì)胞，聚合物產(chǎn)于細(xì)胞中），加2mL氯仿，2mL 酯化液（純甲醇中含3% (v/v)的濃硫酸及2g/L苯甲酸作內(nèi)標(biāo)）于酯化管中，加蓋密封后 于100°C下加熱4小時(shí)。冷卻后加入lmL蒸餾水，充分振蕩后靜置，待氯仿相與水相完全分 層后，取下層氯仿于進(jìn)樣瓶中，運(yùn)用氣相色譜儀（GC，GC-2014,SHIMADZU)進(jìn)行定量和定性 分析。
[0170] 標(biāo)準(zhǔn)樣品準(zhǔn)備：取30 y 1左右的30 %濃度（體積濃度）3-羥基丙酸3HP (日本東 京化成工業(yè)株式會社（TCI)，產(chǎn)品目錄號H0297)水溶液于酯化管中，同時(shí)加10mg聚3-羥基 丁酸酯（3181]^，1]54)，加21]11氯仿，21]11酯化液，加蓋密封后在100 <€進(jìn)行酯化。在如上氣相 檢測條件下，3HP標(biāo)準(zhǔn)樣品在第2. 16分鐘有明顯出峰，表征酯化樣品中的3-羥基丙酸，3HB 標(biāo)準(zhǔn)樣品在第2. 28分鐘有明顯出峰，表征酯化樣品中的3-羥基丁酸。
[0171] 以標(biāo)準(zhǔn)樣品為對照，如果待測細(xì)胞的酯化樣品（待測樣品）在2. 16分鐘和2. 28 分鐘有明顯的出峰，且無其它特異峰出現(xiàn)，說明待測細(xì)胞的酯化樣品存在3HP和3HB單體。 因?yàn)樵诒杉?xì)胞中3HP和3HB只能以聚合物的形式存在（參考文獻(xiàn)："Zhou，Q.，Shi，Z. Y. , Meng, D. C. , ffu, Q. , Chen, J. C. , Chen, G. Q. , 2011. Production of3-hydroxypropionate homopolymer and poly (3-hydroxypropionate-co_4-hydroxybutyrate'，），所以可以證明 有P3HB3HP的積累。
[0172] 結(jié)果顯示：E. coli Transl-Tl (pMDC01，pl5A-68)在 2. 16 分鐘和 2. 28 分鐘有明顯 的出峰，說明為P3HB3HP共聚物。
[0173] 由于峰面積和樣品量正相關(guān)，通過分析氣相檢測得到待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品的出峰 面積，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)樣品的樣品量，計(jì)算得到待測樣品中3HB和3HP的含量（總質(zhì)量），然后除以 冰干細(xì)胞的重量，可得到干細(xì)胞中含有聚合物的比重（wt% )。
[0174] 蟲和13C核磁共振NMR檢測細(xì)胞中共聚物的方法：
[0175] 樣品：從細(xì)胞中提取純化的成膜聚合物（均聚物），具體如下：1)稱取9克干燥細(xì) 胞，分裝到濾紙筒中，使用索氏提取儀進(jìn)行PHA提取，得到固體PHA材料；2)使用氯仿溶解， 并加入10倍體積的無水乙醇中，攪拌混合均勻，靜置，有白色絮狀或粉末狀沉淀析出；3)離 心收集沉淀，對其用無水乙醇反復(fù)浸泡洗滌，離心收集沉淀；4)將經(jīng)洗滌的沉淀進(jìn)行干燥， 得到提純均聚物。
[0176] 實(shí)驗(yàn)條件：核磁儀器（購買JE0L公司，型號ECA-600SCC);采用氘代氯仿⑶C13為 氘代溶液；測試核種和 13C ;掃描次數(shù)：10000次；采用14. 1T超導(dǎo)磁場，氫核子共振頻率 為600MHZ，脈沖角45°，脈沖延遲1. 0s，譜寬31446. 5Hz。
[0177]結(jié)果為：提取干細(xì)胞，并從中提取提純共聚物，送核磁檢測。在圖譜中P為3HP單 體的縮寫，B為3HB的縮寫，通過與P3HP的 1H NMR圖譜比較，P3HB3HP的核磁圖譜上不僅存 在了質(zhì)子共振P (2)和P (3)，同時(shí)還存在三個(gè)額外的質(zhì)子共振B (2)，B (3)和B (4)，這些代表 著共聚物P3HB3HP中的3HB單體，通過B (3)和P (3)的強(qiáng)度分析計(jì)算，3HB的摩爾百分比應(yīng) 該為16. 47%，13C NMR譜圖中，尤其擴(kuò)展譜圖中可以看出在共聚物P3HB3HP中有四個(gè)峰是關(guān) 于羧基C的P(l)和B(l)，其分別為3HP(1)為中心或3HB(1)為中心的共聚單體序列，從左 到右為P⑴*P，P⑴*B，B (1) *P和B (1)祁，其表示單體3HP和3HP，3HP與3HB，3HB和3HP， 3HP和3HB之間均有相互作用，這代表了 3HP和3HB是以一種無序共聚的形式聚合在一起 的，即E. coli Transl-Tl (pMDC01，pl5A-68)成功合成出無序共聚物P3HB3HP (圖2和圖3)。
[0178]在 LBG培養(yǎng)基中培養(yǎng)E. coli Transl-Tl (pMDC01，pl5A-68)，48h 后將菌液離心、水 洗、冰干后得到干細(xì)胞待測樣品，并通過氣相色譜檢測，結(jié)果見表2。該結(jié)果證實(shí)了細(xì)胞中 P3HB3HP共聚物的產(chǎn)生。
[0179] 表2 LBG培養(yǎng)下?lián)u瓶培養(yǎng)的聚合物檢測結(jié)果
[0180]
[0181] 由表2可見，在LBG培養(yǎng)基條件下，工程菌E. coli Trans l-Tl(pZQ08, pl5A-68) 能積累P3HB3HP共聚物。
[0182] 實(shí)施例4、多種重組工程菌（pMDCOl)的構(gòu)建
[0183] 采用如實(shí)施例1中的方法，將實(shí)施例1步驟一構(gòu)建的重組表達(dá)載體pMDCOl用化學(xué) 轉(zhuǎn)化法或電轉(zhuǎn)化方法分別轉(zhuǎn)入到假單胞菌（Pseudomonas spp.)、嗜鹽單胞菌（Halomonas spp.)、羅氏真養(yǎng)桿菌（Ralstonia eutropha)、氣生單胞菌（Aeromonas spp.)等，對所得重 組工程菌，采用常規(guī)方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，然后通過如實(shí)施例2的方法進(jìn)行氣相色譜的方法 均可檢測出P3HP的合成。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 重組菌A的制備方法，包括如下步驟：將甘油三磷酸脫氫酶的編碼基因、三磷酸甘油 磷酸酶的編碼基因、甘油脫水酶1的編碼基因、甘油脫水酶2的編碼基因、甘油脫水酶3的 編碼基因、甘油脫水酶激活酶A的編碼基因、甘油脫水酶激活酶B的編碼基因、3-羥基丙醛 脫氫酶的編碼基因、PHA聚合酶的編碼基因、3-羥基丙酰輔酶A連接酶的編碼基因、P -酮 基硫解酶的編碼基因和NADPH依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶的編碼基因?qū)胧荏w菌，得到 重組菌A。2. 重組菌B的制備方法，包括如下步驟：將甘油三磷酸脫氫酶的編碼基因、三磷酸甘油 磷酸酶的編碼基因、甘油脫水酶1的編碼基因、甘油脫水酶2的編碼基因、甘油脫水酶3的 編碼基因、甘油脫水酶激活酶A的編碼基因、甘油脫水酶激活酶B的編碼基因、3-羥基丙醛 脫氫酶的編碼基因、PHA聚合酶的編碼基因和3-羥基丙酰輔酶A連接酶的編碼基因?qū)胧?體菌，得到重組菌B。3. 重組菌C的制備方法，包括如下步驟：將甘油三磷酸脫氫酶的編碼基因、三磷酸甘油 磷酸酶的編碼基因、甘油脫水酶1的編碼基因、甘油脫水酶2的編碼基因、甘油脫水酶3的 編碼基因、甘油脫水酶激活酶A的編碼基因、甘油脫水酶激活酶B的編碼基因、PHA聚合酶 的編碼基因、3-羥基丙酰輔酶A連接酶的編碼基因、醇脫氫酶的編碼基因和醛脫氫酶的編 碼基因?qū)胧荏w菌，得到重組菌C。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于： 所述甘油三磷酸脫氫酶的氨基酸序列為序列表中序列13或保有功能的隨機(jī)或/和定 點(diǎn)誘變序列；和/或 所述三磷酸甘油磷酸酶的氨基酸序列為序列表中序列14或保有功能的隨機(jī)或/和定 點(diǎn)誘變序列；和/或 所述甘油脫水酶1的氨基酸序列為序列表中序列15或保有功能的隨機(jī)或/和定點(diǎn)誘 變序列；和/或 所述甘油脫水酶2的氨基酸序列為序列表中序列16或保有功能的隨機(jī)或/和定點(diǎn)誘 變序列；和/或 所述甘油脫水酶3的氨基酸序列為序列表中序列17或保有功能的隨機(jī)或/和定點(diǎn)誘 變序列；和/或 所述甘油脫水酶激活酶A的氨基酸序列為序列表中序列18或保有功能的隨機(jī)或/和 定點(diǎn)誘變序列；和/或 所述甘油脫水酶激活酶B的氨基酸序列為序列表中序列19或保有功能的隨機(jī)或/和 定點(diǎn)誘變序列；和/或 所述3-羥基丙醛脫氫酶的氨基酸序列為序列表中序列20或保有功能的隨機(jī)或/和定 點(diǎn)誘變序列；和/或 所述PHA聚合酶的氨基酸序列為序列表中序列21或保有功能的隨機(jī)或/和定點(diǎn)誘變 序列；和/或 所述3-羥基丙酰輔酶A連接酶的氨基酸序列為序列表中序列22或保有功能的隨機(jī)或 /和定點(diǎn)誘變序列；和/或 所述醇脫氫酶的氨基酸序列為序列表中序列23或保有功能的隨機(jī)或/和定點(diǎn)誘變序 列；和/或 所述醛脫氫酶的氨基酸序列為序列表中序列24或保有功能的隨機(jī)或/和定點(diǎn)誘變序 列；和/或 所述0 -酮基硫解酶的氨基酸序列為序列表中序列25或保有功能的隨機(jī)或/和定點(diǎn) 誘變序列；和/或 所述NADPH依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶的氨基酸序列為序列表中序列26或保有功 能的隨機(jī)或/和定點(diǎn)誘變序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于： 所述甘油三磷酸脫氫酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1或保有功能的隨 機(jī)或/和定點(diǎn)誘變序列；和/或 所述三磷酸甘油磷酸酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列2或保有功能的隨 機(jī)或/和定點(diǎn)誘變序列；和/或 所述甘油脫水酶1的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列3的第35-1702位或保有 功能的隨機(jī)或/和定點(diǎn)誘變序列；和/或 所述甘油脫水酶2的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列3的第1715-2299位或保 有功能的隨機(jī)或/和定點(diǎn)誘變序列；和/或 所述甘油脫水酶3的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列3的第2302-2727位或保 有功能的隨機(jī)或/和定點(diǎn)誘變序列；和/或 所述甘油脫水酶激活酶A的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列4或保有功能的隨 機(jī)或/和定點(diǎn)誘變序列；和/或 所述甘油脫水酶激活酶B的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列5或保有功能的隨 機(jī)或/和定點(diǎn)誘變序列；和/或 所述3-羥基丙醛脫氫酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列6或保有功能的隨 機(jī)或/和定點(diǎn)誘變序列；和/或 所述PHA聚合酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列7或保有功能的隨機(jī)或/和 定點(diǎn)誘變序列；和/或 所述3-羥基丙酰輔酶A連接酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列8或保有功 能的隨機(jī)或/和定點(diǎn)誘變序列；和/或 所述醇脫氫酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列9或保有功能的隨機(jī)或/和定 點(diǎn)誘變序列；和/或 所述醛脫氫酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列10或保有功能的隨機(jī)或/和 定點(diǎn)誘變序列；和/或 所述P -酮基硫解酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列11或保有功能的隨機(jī) 或/和定點(diǎn)誘變序列；和/或 所述NADPH依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列12 或保有功能的隨機(jī)或/和定點(diǎn)誘變序列。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述受體菌為革蘭氏陰性菌； 所述革蘭氏陰性菌具體為大腸桿菌、假單胞菌、嗜鹽單胞菌、羅氏真養(yǎng)桿菌或氣生單胞 菌。7. 由權(quán)利要求1-6中任一所述的方法制備得到的所述重組菌A、所述重組菌B或所述 重組菌c。8. 權(quán)利要求7中所述重組菌A在生產(chǎn)由3-羥基丙酸和3-羥基丁酸組成的共聚物中的 應(yīng)用；或 權(quán)利要求7中所述重組菌B或所述重組菌C在生產(chǎn)3-羥基丙酸均聚物中的應(yīng)用。9. 生產(chǎn)由3-羥基丙酸和3-羥基丁酸組成的共聚物的方法，包括如下步驟：將所述重 組菌A進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到由3-羥基丙酸和3-羥基丁酸組成的共聚物； 或 生產(chǎn)3-羥基丙酸均聚物的方法，包括如下步驟：將所述重組菌B或所述重組菌C進(jìn)行 發(fā)酵培養(yǎng)，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到3-羥基丙酸均聚物。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為30-42°C ;或 所述發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為48h ;或 所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為：酵母提取物5g/L，蛋白胨IOg/ L，氯化鈉10g/L，葡萄糖20g/L ;pH6-8 ;或 所述發(fā)酵培養(yǎng)的方式為旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用葡萄糖合成3-羥基丙酸和3-羥基丁酸共聚物的重組菌的制備方法。該方法可包括如下步驟：將甘油三磷酸脫氫酶的編碼基因、三磷酸甘油磷酸酶的編碼基因、甘油脫水酶1的編碼基因、甘油脫水酶2的編碼基因、甘油脫水酶3的編碼基因、甘油脫水酶激活酶A的編碼基因、甘油脫水酶激活酶B的編碼基因、3-羥基丙醛脫氫酶的編碼基因、PHA聚合酶的編碼基因、3-羥基丙酰輔酶A連接酶的編碼基因、β-酮基硫解酶的編碼基因和NADPH依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶的編碼基因?qū)胧荏w菌，得到重組菌A。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，通過代謝路徑的調(diào)控，該工程菌利用葡萄糖為碳源可一步生產(chǎn)3-羥基丙酸和3-羥基丁酸的共聚物。
【IPC分類】C12N15/70, C12P7/42, C12R1/01, C12N15/74, C12R1/19, C12R1/38
【公開號】CN105039376
【申請?zhí)枴緾N201510349697
【發(fā)明人】陳國強(qiáng), 孟德川, 王穎, 吳瓊, 陳金春
【申請人】清華大學(xué)
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年6月23日