重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法、重組病毒毒株及其應(yīng)用、重組蛋白及亞單位疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物病毒學(xué)和基因工程學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及重組表達(dá)載體及其構(gòu)建 方法、重組病毒毒株及其應(yīng)用、重組蛋白及亞單位疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)是一種高度接觸性疾病。主要表現(xiàn)為母豬繁殖障礙 及育肥豬和小豬呼吸困難。GP5是PRRSV重要的糖蛋白，能夠誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生及免疫保 護(hù)。因此可作為研究對(duì)抗PRRSV的基因工程疫苗的主要靶位點(diǎn)。雖然滅活和修飾后的活疫 苗可以利用，但是其保護(hù)性不完整。因此探索和研發(fā)出對(duì)抗PRRSV感染的有效疫苗是一項(xiàng) 十分緊迫的任務(wù)。
[0003] 豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2 virus，簡(jiǎn)稱PCV2)是引起仔豬斷 奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（Post-weaning multisystemic syndrome，PMWS)的主要病原，弓丨 起斷奶仔豬發(fā)生進(jìn)行性消瘦、咳嗽、呼吸困難等。目前PCV2已在世界各地廣泛存在并流行， 給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬圓環(huán)病毒2型基因組含有兩個(gè)主要的開放閱讀框， 即0RF1和0RF2,其中0RF2是構(gòu)成病毒衣殼蛋白（Cap)的主要成分，其主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜 上，具有自我裝配成病毒樣粒子.并且經(jīng)研究證實(shí)0RF2蛋白中含有可中和病毒的中和抗原 表位，因此，是設(shè)計(jì)新型疫苗的首選目標(biāo)基因。
[0004] 作為RNA病毒，PRRSV的基因在合成時(shí)容易出現(xiàn)內(nèi)在性錯(cuò)誤，可出現(xiàn)點(diǎn)突變，刪除、 添加和毒株間基因重組，而滅活疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的能力較弱，產(chǎn)生的保護(hù)作用較短，藍(lán)耳 病還存在"抗體依賴性增強(qiáng)作用"。又因?yàn)镻CV2可導(dǎo)致藍(lán)耳病的發(fā)生和發(fā)展，所以利用基因 工程方法研制PRRSV和PCV2二價(jià)亞單位疫苗將成為徹底防制該病的重要方向。因此，該亞 單位疫苗在豬藍(lán)耳病和豬圓環(huán)病的防制方面將具有很廣泛的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法、重組病毒毒株及其應(yīng)用、重組 蛋白及亞單位疫苗。本發(fā)明成功PCR擴(kuò)增PRRSV-GP5基因和PCV2-Cap基因及構(gòu)建高效重 組表達(dá)質(zhì)粒BacSC-Dual-GP5_Cap。此外，本發(fā)明重組毒株所表達(dá)的重組蛋白，其產(chǎn)物表達(dá)產(chǎn) 量很高。用研制的BacSC-Dual-GP5-Cap亞單位疫苗制品對(duì)本動(dòng)物是安全的。疫苗免疫效 力試驗(yàn)結(jié)果表明，利用基因工程方法研制的PRRSV和PCV2具有良好的免疫原性，該亞單位 疫苗在豬藍(lán)耳病和豬圓環(huán)病的防制方面將具有很廣泛的應(yīng)用前景。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種重組表達(dá)載體，由具有如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的PRRSV GP5基因片段、具有如SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的PCV2 Cap基因片段與質(zhì)粒載體重組 構(gòu)建而成。
[0008] 桿狀病毒細(xì)胞進(jìn)入是通過gp64蛋白介導(dǎo)，在宿主細(xì)胞表達(dá)后，gp64蛋白SS直接 穿過細(xì)胞膜，并以三聚體的形式出現(xiàn)于受感染細(xì)胞表面，該融合蛋白的表達(dá)與本體的糖蛋 白gp64啟動(dòng)后，轉(zhuǎn)入質(zhì)膜，進(jìn)入桿狀病毒包膜內(nèi)。以假型桿狀病毒作為一個(gè)潛在的疫苗傳 遞系統(tǒng)的方法已被廣泛使用。
[0009] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，重組表達(dá)載體由表達(dá)載體BacSC-Dual在其Kpn I和 Sma I酶切位點(diǎn)間插入所述具有如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的PRRSV GP5的基因片段， 以及所述表達(dá)載體BacSC-Dual在其Pst I和EcoR I酶切位點(diǎn)間插入SEQ ID No. 2所示核 苷酸序列的PCV2 Cap基因片段獲得。
[0010] 具體的，重組表達(dá)載體由表達(dá)載體BacSC-Dual在其Kpn I和Sma I酶切位點(diǎn)間插 入gp64CAD、gp64TM、如 SEQ ID No.l 所示核苷酸序列的PRRSV GP5 基因片段、His6、gp64ss， 以及所述表達(dá)載體BacSC-Dual在其BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)間插入gp64ss、His6、SEQ 10如.2所示核苷酸序列的？(^2 0&口基因片段4口6肛114口6扣40獲得。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種如上述重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0012] 步驟1 :擴(kuò)增獲得如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的PRRSV GP5基因片段；
[0013] 步驟2 :擴(kuò)增獲得如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的PRRSV GP5的基因片段；
[0014] 步驟3 :將所述表達(dá)載體BacSC-Dual經(jīng)Xho I、Xba I、Pst I和EcoR分別雙酶切， 將如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的PRRSV GP5基因片段與如SEQ ID No. 1所示核苷酸序 列的PRRSV GP5的基因片段轉(zhuǎn)化連接，獲得所述重組表達(dá)載體。
[0015] 在本發(fā)明的一些【具體實(shí)施方式】中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒BacSC-Dual-GP5_Cap包括：
[0016] 1、PRRSV-GP5基因和PCV2_Cap基因的引物設(shè)計(jì)
[0017] 根據(jù)豬繁殖與呼吸綜合癥GP5蛋白基因和豬圓環(huán)病毒2型的Cap基因序列設(shè)計(jì)特 異性引物P1、P2、P3和P4,引物序列如下：
[0018] 6卩5-卩1:如 SEQ ID No. 4 所示，5' GCTGCGCGCATGAATGGCATCTTC 3'
[0019] GP5-P2Jn SEQ ID No. 5 所示，
[0020] 5, GGGGCATGCAAGTGGGGGGTCTTTAAG 3，，
[0021] Cap-P3:如 SEQ ID No. 6 所示，5' GCTCTCGAGAGCAACAACAGCAG 3'，
[0022] Cap-P4:如 SEQ ID No. 7 所示，5' GATCTGCAGGAGACGACCCCATTGTT3' ；
[0023] 根據(jù)桿狀病毒BacSC-Dual載體酶切位點(diǎn)，加入酶切位點(diǎn)Xho I、Xba I、Pst I和 EcoR，上述引物均由上海生工生物工程公司合成。以豬藍(lán)耳T1株的GP5蛋白基因和PCV2 豫A株的全基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，并以重組質(zhì)粒pT-PCV為模板（曹勝波等.豬II型 圓環(huán)病毒豫A株的全基因組克隆與序列分析，以Pl、P2、P3和P4為引物對(duì)CP5和Cap基因 進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增目的片段大小分別為507bp和570bp。反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳 檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。
[0024] 2、重組表達(dá)質(zhì)粒BacSC-Dual-GP5_Cap的構(gòu)建
[0025] 將PCR擴(kuò)增的GP5和Cap蛋白基因片段純化回收，轉(zhuǎn)化至克隆質(zhì)粒中，經(jīng)Xho I、Xba I、Pst I和EcoR分別雙酶切，后將GP5基因與Cap基因連接，將連接產(chǎn)物克隆至表達(dá)載體 BacSC-Dual上，獲得天然表達(dá)GP5_Cap基因的重組真核質(zhì)粒BacSC-Dual-GPS-CapaDHlOBac 大腸桿菌分別轉(zhuǎn)化為重組質(zhì)粒BacSC-Dual_GP5_Cap和非重組質(zhì)粒BacSC-Dual。非重組質(zhì) 粒BacSC-Dual作為陰性對(duì)照。選擇經(jīng)過兩輪藍(lán)/白選擇菌落后，按照Invitrogen公司規(guī) 定的程序從白色菌落中分離到重組質(zhì)粒。重組克隆后用P1和P4特異性引物進(jìn)行PCR驗(yàn) 證。重組桿狀病毒DNA分別命名為BacSC-Dual-GP5-Cap與BacSC-Dual。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種重組病毒毒株，由上述重組表達(dá)載體經(jīng)包裝細(xì)胞包裝而成。
[0027] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，重組病毒毒株的生物保藏編號(hào)為CGMCC No. 2389。
[0028] 本發(fā)明還提供了上述重組桿狀病毒毒株在制備預(yù)防和/或治療PRRSV感染相關(guān)疾 病和/或PCV2感染相關(guān)疾病的藥物制劑的應(yīng)用。
[0029] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述PRRSV感染相關(guān)疾病為豬繁殖與呼吸綜合征； 所述PCV2感染相關(guān)疾病為多系統(tǒng)衰竭綜合征。
[0030] 本發(fā)明還提供了一種如上述重組病毒毒株表達(dá)的重組蛋白。
[0031] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，重組蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo. 3所示。
[0032] 此外，本發(fā)明還提供了一種亞單位疫苗，包含：
[0033] (I)如上所述的重組病毒毒株表達(dá)的重組蛋白或與其同源性達(dá)80%以上的蛋白；
[0034] 和 / 或
[0035] (II)如上所述的重組蛋白或與其同源性達(dá)80%以上的蛋白。
[0036] 本發(fā)明提供了一種重組表達(dá)載體，由具有如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的PRRSV GP5基因片段、具有如SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的PCV2 Cap基因片段與質(zhì)粒載體重組 構(gòu)建而成。本發(fā)明成功PCR擴(kuò)增PRRSV-GP5基因和PCV2-Cap基因及構(gòu)建高效重組表達(dá)質(zhì) 粒BacSC-Dual