R擴(kuò)增條件為：
[0057] 95 °C預(yù)變性5分鐘；95 °C變性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸5分鐘，反應(yīng)30個 循環(huán)；72°C延伸10分鐘。
[0058] 將純化的PCR產(chǎn)物加入與Hind III和Xho I 37°C雙酶切3小時，16°C過夜連接到 同樣雙酶切處理的質(zhì)粒pET-21b載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒。采用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主菌大 腸桿菌DH5 a，轉(zhuǎn)化菌液涂布氨芐霉素LB平板，37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性生長菌菌落，提取 質(zhì)粒驗證，測得核苷酸序列見SEQ ID No. 1。
[0059] 將獲得的含有重組質(zhì)粒的重組大腸桿菌BL21 (DE3)接種于LB培養(yǎng)液，37°C，180r/ min培養(yǎng)至0D6。。約0. 8,加入終濃度0. 5mM IPTG，25°C、100r/min過夜誘導(dǎo)，離心收集細(xì)胞， 用pH7. 0、50mmol/L磷酸鈉緩沖溶液重新懸浮菌體，并置于冰水浴中，超聲波破碎細(xì)胞壁20 分鐘，12000r/min離心30分鐘，上清液通過鎳親和層析純化獲得電泳純重組酶，SDS-PAGE 顯示重組酶單亞基分子量約為170kDa(如圖1所示）。
[0060] 2. 0 -N-乙酰氨基已糖苷酶的性質(zhì)研究
[0061] 研究了重組0 -N-乙酰氨基已糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)，該酶專一性水解0 -D-N-乙 酰氨基已糖苷鍵，對對硝基苯-N-乙酰-D-葡萄糖胺的水解活性高于對硝基苯-N-乙 酰-0-D-半乳糖胺。
[0062] 在適當(dāng)?shù)臏囟确秶?0°C~70°C)內(nèi)，每5°C為一個梯度測定酶在該溫度下的相對 酶活。結(jié)果表明：酶適宜反應(yīng)的溫度為45°C~55°C，最適反應(yīng)溫度為55°C。將酶在上述溫 度梯度下保溫30min后測定相對酶活。結(jié)果表明：酶在55°C以下比較穩(wěn)定，55°C以上失活 較快，70°C失去所有的酶活。
[0063] 用不同pH的緩沖液配制酶反應(yīng)體系，測定相對酶活，結(jié)果表明：酶適宜反應(yīng)的pH 范圍比較廣，為pH4. 5~8. 0,最適反應(yīng)pH為5. 0~7. 0 ;酶在不同pH的緩沖液中4°C保存 24小時，測定相對酶活，結(jié)果表明酶在pH 4. 0~11. 0范圍內(nèi)穩(wěn)定。
[0064] 以對硝基苯-N-乙酰-0 -D-葡萄糖胺為底物，在酶活測定反應(yīng)體系中分別加入終 濃度為lmm〇l/L的各種金屬離子，10mmol/L的EDTA，測定相對酶活。結(jié)果顯示，Zn 2+和Hg 2+ 顯著抑制酶活，NH4+、Na+、Mg2+、Mn 2+、Fe3+、Fe2+、K+、Cu2+、Co 2+、Ca2+對酶有激活作用，EDTA 對酶 活性沒有抑制作用。
[0065] 上述酶活測定方法為：50 y L稀釋一倍的純酶與450 y L、2mmol/L的糖苷底物溶液 混合，于37°C反應(yīng)10分鐘，加lmL、0. 5mol/L的Na2C03溶液終止反應(yīng)，測定0D
[0066] 上述不同pH緩沖液分別為：醋酸一醋酸鈉緩沖液pH3. 6~5. 0 ;磷酸氫二鉀一磷 酸二氫鉀緩沖液PH5. 5~8. 5 ;甘氨酸一氫氧化鈉緩沖液pH8. 7~10. 6 ;碳酸氫鈉一氫氧化 鈉緩沖液PH10. 0~11.0。
[0067] 3. 0 -N-乙酰氨基已糖苷酶催化合成寡糖GalNAc 0 l_3Gal 0 l-4Glc
[0068] 將重組P -N-乙酰氨基已糖苷酶在以對硝基苯-N-乙酰-D-半乳糖胺為糖 基供體，乳糖為糖基受體進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)。研究了轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)條件如糖基供體底物濃度 (5-30mM)、糖基受體底物濃度（100-400mM)、pH(3. 6-12. 0)、反應(yīng)溫度（35°C -60°C )和時間 (l-14h)對轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物產(chǎn)率的影響，對硝基苯-N-乙酰-D-半乳糖胺10mM、乳糖400mM 時45°C反應(yīng)4h產(chǎn)物產(chǎn)率達(dá)到最高。將反應(yīng)產(chǎn)物煮沸l(wèi)Omin終止反應(yīng)，于12000r/min離心 lOmin，取上清液進(jìn)行薄層層析分析，結(jié)果顯示反應(yīng)產(chǎn)物為單一寡糖，高效液相色譜定量分 析產(chǎn)物產(chǎn)量為55. 4%。進(jìn)一步對產(chǎn)物采用Bio-gel P2柱層析進(jìn)行純化，質(zhì)譜和核磁共振分 析鑒定其結(jié)構(gòu)為GalNAc 0 l-3Gal 0 l-4Glc (圖2、圖3、圖4)。
[0069] 上述薄層層析條件如下：
[0070] 薄層層析板點樣，在展層劑（正丁醇：無水乙醇：水=5:3:2)中展開，霧噴顯色 劑（苯胺、二苯胺、磷酸），于86°C烘烤10分鐘，糖斑點顯色后，產(chǎn)物單一。
[0071] 上述高效液相色譜分析所用設(shè)備及條件如下：
[0072] 安捷倫（Agilent) 1200型高壓液相色譜儀；安捷倫G1314B紫外檢測器；Waters SpherisorbNH2分析柱（4. 6X250mm);流動相為乙腈 / 水（72 :28，v/v);流速為 1. OmL/min， 柱溫30°C;結(jié)果分析軟件為Agilent Chemstation B.04.01版。反應(yīng)液按l:1.5(v/v)的 比例加水稀釋，煮沸離心后上清用0. 22 ym的濾膜過濾后，進(jìn)樣分析。
[0073] 4. -N-乙酰氨基已糖苷酶催化合成寡糖GlcNAc l_3Gal l-4Glc
[0074] 將重組0 -N_乙酰氨基已糖苷酶在以對硝基苯-N-乙酰-0 -D-葡萄糖胺為糖 基供體，乳糖為糖基受體進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)。研究了轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)條件如糖基供體底物濃度 (5-40mM)、糖基受體底物濃度（100-400mM)、pH(3. 6-12. 0)、反應(yīng)溫度（35°C -60°C )和時間 (10-300min)對轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物產(chǎn)率的影響，結(jié)果表明酶在對硝基苯-N-乙酰-0 -D-葡萄糖胺 20mM、乳糖400mM時，55°C反應(yīng)90min產(chǎn)物產(chǎn)率達(dá)到最高。將反應(yīng)產(chǎn)物煮沸l(wèi)Omin終止反應(yīng)， 于12000r/min離心10min，取上清液進(jìn)行薄層層析分析，結(jié)果顯示反應(yīng)產(chǎn)物為單一寡糖，高 效液相色譜定量分析產(chǎn)物產(chǎn)量為44. 9%，進(jìn)一步對產(chǎn)物采用Bio-gel P2柱層析進(jìn)行純化， 質(zhì)譜和核磁共振分析鑒定其結(jié)構(gòu)分別為GlcNAc l-3Gal l-4Glc (圖5、圖6、圖7)。
[0075] 薄層層析條件及高效液相色譜分析所用設(shè)備及條件同3。
【主權(quán)項】
1. 一種區(qū)域選擇性專一的轉(zhuǎn)糖基P-N-乙酰氨基已糖苷酶的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)糖基 0 -N-乙酰氨基已糖苷酶的表達(dá)基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下： 將轉(zhuǎn)糖基0 -N-乙酰氨基已糖苷酶與對硝基苯-N-乙酰-P -D-已糖胺和乳糖溶液混 合，配制成反應(yīng)體系，在45~55 °C條件下，反應(yīng)1. 5~4h，終止反應(yīng)，純化，制得N-乙酰已 糖胺寡糖。3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述轉(zhuǎn)糖基P -N-乙酰氨基已糖苷酶的制備 方法如下： (1) 將核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的基因序列插入質(zhì)粒pET-21b中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 大腸桿菌BL21 (DE3)，制得重組大腸桿菌； (2) 將步驟（1)制得的重組大腸桿菌經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，再經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)后，收集細(xì)胞，細(xì)胞 破碎、純化，制得轉(zhuǎn)糖基P-N-乙酰氨基已糖苷酶。4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟（1)中，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示的基因序列以兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum)JCM1254的基因組DNA為模 板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得，PCR引物核苷酸序列如下所示： 引物 F :5' -agtcaagcttagcgatgacaatcttgcact-3? Hind III 引物 R :5' -atatctcgagggcgacctcgtcaggcgtgt-3? Xho I PCR體系如下（總體積100 y L): IOXPCR buffer 10yL，2.5mmol/L dNTP 8 1^、20以111〇1/1引物各2 1^、100即/^14莫 板 I y L、5U/ y L TaKaRa LA Taq 酶 I y L，超純水 76 y L。 PCR擴(kuò)增程序如下： 95 °C預(yù)變性5分鐘；95 °C變性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸5分鐘，反應(yīng)30個循環(huán)； 72 °C延伸10分鐘。5. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟（2)中，擴(kuò)大培養(yǎng)條件為：37°C、 150 ~180r/min 培養(yǎng)至 0D6。。為 0? 4 ~0? 6〇6. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟（2)中，擴(kuò)大培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)液， 配制方法如下： 蛋白胨 l〇g/L、酵母膏 5g/L、NaCl 7g/L、pH 7.0，121°C滅菌 20 分鐘。7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述擴(kuò)大培養(yǎng)基還包括濃度為40~60 y g/ mL的氨節(jié)霉素。8. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟（2)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)為在擴(kuò)大培養(yǎng)后， 向培養(yǎng)液中加入IPTG，使培養(yǎng)液中IPTG的濃度為0. 5mM~ImM，在25~28°C、lOOr/min繼 續(xù)過夜培養(yǎng)。9. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述反應(yīng)體系中，對硝基苯-N-乙 酰-P -D-已糖胺的反應(yīng)濃度為10~20mM，乳糖反應(yīng)濃度為300~400mM，pH為5. 0~6. 0 ; 優(yōu)選的，所述反應(yīng)體系由濃度為50mM的磷酸鈉緩沖液配制，pH為5. 8。10. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述純化采用柱層析進(jìn)行純化。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種區(qū)域選擇性專一的轉(zhuǎn)糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的應(yīng)用，步驟如下：將轉(zhuǎn)糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶與對硝基苯-N-乙酰-β-已糖胺和乳糖溶液混合，配制成反應(yīng)體系，反應(yīng)后，終止，純化，制得N-乙酰已糖胺寡糖。該方法所需要的底物價格便宜，易于獲得，且反應(yīng)條件溫和，操作簡便，大大降低了N-乙酰已糖胺寡糖的生產(chǎn)成本，適合于GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc和GalNAcβ1-3Galβ1-4Glc的規(guī)?；铣?，具有潛在的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12P19/18, C12N9/24
【公開號】CN105039463
【申請?zhí)枴緾N201510496988
【發(fā)明人】肖敏, 陳曉迪, 盧麗麗, 徐莉
【申請人】山東大學(xué)
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年8月13日