基于外源基因旁側(cè)序列鑒定轉(zhuǎn)基因水稻吉生粳2號的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種基于外源基因旁側(cè)序列鑒定轉(zhuǎn)基因水稻吉生 粳2號的方法，及相應的引物和純合型轉(zhuǎn)基因水稻吉生粳2號特異性PCR擴增片段的核苷 酸序列。
【背景技術】
[0002] 目前，已報道的轉(zhuǎn)基因作物成分檢測方法，主要包括針對外源目的基因和調(diào)控元 件檢測的基因特異性檢測方法，針對遺傳轉(zhuǎn)化載體的特征建立的載體特異性檢測方法，針 對外源DNA插入特征序列建立的轉(zhuǎn)基因作物品系特異性檢測方法等三類。與前兩種方法相 比，轉(zhuǎn)基因作物品系特異性檢測方法具有最高的特異性，最適合轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定性和定量 檢測。由于每個轉(zhuǎn)基因作物品系，外源基因在受體基因組中的整合位點具有隨機性，即相同 的載體多次轉(zhuǎn)化，整合的位置具有高度的特異性和不可重復性，因此利用外源基因旁側(cè)序 列進行品系特異性檢測的方法具有特異性和準確性，并且能夠鑒別外源DNA插入的純合或 雜合狀態(tài)。
[0003] 水稻是我國乃至全世界最重要的糧食作物之一，是世界上食用人口最多、歷史最 悠久的農(nóng)作物。隨著轉(zhuǎn)基因技術在水稻中的廣泛研究和應用，已經(jīng)有多個轉(zhuǎn)基因水稻品系 進行了環(huán)境釋放，申請商業(yè)化種植。對轉(zhuǎn)基因植物進行品系特異性檢測是對轉(zhuǎn)基因植物進 行監(jiān)督管理，保障其健康發(fā)展的重要技術基礎。目前已經(jīng)有部分專利和文獻報道了利用品 系特異性PCR檢測方法鑒定轉(zhuǎn)基因植物的方法。張琰等人于2010年根據(jù)轉(zhuǎn)基因水稻品系科 豐6號的外源插入片段的邊界序列設計了科豐6號特異性引物和特異性探針，提供了可以 快速檢測轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號的方法，為轉(zhuǎn)基因安全提供了保證；金蕪軍等人于2013年基 于轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻品系TT51-1的旁側(cè)序列建立了鑒定純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻品系TT51-1 的方法。然而，在對現(xiàn)有的專利和文獻的分析中發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外目前還沒有鑒定轉(zhuǎn)基因抗蟲水 稻品系吉生粳2號檢測方法的相關報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種基于外源基因旁側(cè)序列鑒定轉(zhuǎn)基因水稻吉生粳2號的方法，及相 應的引物，并提供純合型轉(zhuǎn)基因水稻吉生粳2號特異性PCR擴增片段的核苷酸序列。
[0005] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的一種檢測轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻品系吉生粳2號的3 條特異性引物，其包括：
[0006]正向引物SEQIDN0. 1: ACGAGACATGGCAAAGTTTGATT，
[0007]反向引物SEQIDN0. 2: CGCGCTTAAAGATATACAAACCA，
[0008] T-DNA特異性引物SEQIDN0. 3: TAATGTGTGAGTAGITCCCAGATAAG。
[0009] 該3條引物是基于轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻品系吉生粳2號外源基因的旁側(cè)序列而設計的 引物，其正向引物和反向引物依據(jù)水稻基因組序列設計，位于水稻1號染色體（GenBank登 記號：NC_008394. 4)的 41607255-41607277bp 和 41608280-41608258bp 位置，T-DNA 特異 性引物按照T-DNA左邊界區(qū)域序列設計，位于T-DNA左邊界338-313bp區(qū)段。利用該引物 在特定的擴增條件下進行聚合酶鏈式擴增（PCR)，在以純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻品系吉生粳 2號的基因組DNA為模板可以擴增出一條短片段SEQIDNO. 4(446bp)，以雜合型轉(zhuǎn)基因抗蟲 水稻品系吉生粳2號的基因組DNA為模板擴增出兩條片段（1026bp和446bp)，以非轉(zhuǎn)基因 水稻的基因組DNA為模板擴增出一條PCR條帶（1026bp)。
[0010] 本發(fā)明提供基于外源基因旁側(cè)序列建立的鑒定轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻品系吉生粳2號 的方法，包括步驟：1)提取植物基因組；2)以步驟1)的基因組為模板，利用上述特異性引 物進行PCR檢測。
[0011] PCR 反應條件優(yōu)選為：94°C 2min ;94°C 20s，55°C 40s，35 個循環(huán)；72°C lOmin。
[0012] PCR反應體系優(yōu)選為：：2y 1 200ng/y 1模板，康為世紀2XEs Taq MasterMix(含 有Es Taq DNA Polymerase，PCR bufTer，3mM MgCl2,400uM dNTP mix)，liil lOyM 正向弓| 物，lyl 10yM反向引物，lyl T-DNA特異性引物，補ddH20至20yl。
[0013] 本發(fā)明首次基于外源基因旁側(cè)序列建立轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻品系吉生粳2號的鑒定 方法，并且能夠鑒定外源基因的純合型或雜合型，可用于轉(zhuǎn)基因檢測用標準物質(zhì)候選物的 篩選鑒定，為轉(zhuǎn)基因安全提供了保證。在轉(zhuǎn)基因作物遺傳育種過程中，需要將轉(zhuǎn)基因材料與 其它材料進行雜交、轉(zhuǎn)育以獲得適合的栽培品種，利用分子生物學手段快速、簡便鑒定純合 體/雜合體育種材料，有利于縮短育種進程，為后續(xù)的轉(zhuǎn)基因作物遺傳育種奠定了基礎。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明通過PCR在水稻中的擴增結果；其中，M :100bp DNA ladder ;1 :空白 對照；2:非轉(zhuǎn)基因水稻吉粳88 ;3:外源基因雜合的粳稻品系吉生粳2號；4:外源基因純合 的粳稻品系吉生粳2號。
【具體實施方式】
[0015] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0016] 以下實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 的《分子克隆：實驗室手冊》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中 所述的條件，或按照儀器或試劑制造廠商所建議的條件。所用試劑和材料均為市售商品。
[0017] 實施例
[0018]利用引物，其中正向引物為SEQIDNO. 1: ACGAGACATGGCAAAGTTTGATT，反向引物為 SEQIDN0. 2: CGCGCTTAAAGATATACAAACCA, T-DNA特異性引物為SEQIDN0. 3: TAATGTGTGAGTAGT TCCCAGATAAG，進行PCR擴增鑒定待測樣品是否為轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻粳稻品系吉生粳2號，并 且可鑒定出外源基因的純合或雜合狀態(tài)。
[0019] 1?實驗材料
[0020] 1. 1植物材料
[0021] 轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻品系吉生粳2號，非轉(zhuǎn)基因水稻吉粳88。
[0022] 1. 2酶與試劑
[0023] 分子生物學試劑，康為世紀2XEs Taq MasterMix(含有Es Taq DNA Polymerase，PCR bufTer，3mM MgCl2,400uM dNTP mix), lOObp DNA Ladder Marker購自 Takara〇
[0024] 其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。引物由上海生工生物技術有限公司合 成。
[0025] 1. 3實驗儀器
[0026] DNA處理儀器：低溫混合球磨儀MM400 (Retsch);
[0027] PCR擴增儀：BioRAD(AB Applied Biosystems veriti 96well Thermal Cycler(AB))；
[0028] 核酸電泳儀：DYY-11型核酸電泳儀（北京六一儀器廠）；
[0029] DNA電泳分析系統(tǒng)：GeneSnap凝膠成像分析系統(tǒng)；
[0030] 其它儀器包括：恒溫水浴鍋、電子天平、離心機、渦旋儀、純水儀、恒溫培養(yǎng)箱等。
[0031] 2?實驗方法
[0032] 2. 1水稻基因組DNA的提取
[0033] 水稻單株種植，取幼嫩葉片作為DNA提取材料，用DNA樣品提取液[200mM Tris-HCl(pH7.6)，25mM EDTA，250mM NaCl，0.5% SDS