牛fabp3基因轉(zhuǎn)錄水平熒光定量pcr檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及牛FABP3基因轉(zhuǎn)錄水平熒光定量PCR檢測試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR)是DNA體外操作技術(shù)中最常 用的技術(shù)。PCR技術(shù)將模板DNA、特異引物、dNTPs底物、耐熱DNA聚合酶、鎂離子等放在同 一個緩沖反應(yīng)體系中，進行反復(fù)高溫變性、低溫退火、中溫鏈延伸的熱循環(huán)，實現(xiàn)靶DNA片 段在反應(yīng)液中呈2 n倍擴增(其中n為熱循環(huán)次數(shù))。
[0003] 熒光定量PCR技術(shù)是在普通PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合實時熒光檢測技術(shù)和計算機 分析技術(shù)所發(fā)展起來的基因定量方法。熒光定量PCR在普通PCR反應(yīng)體系中加入特定的熒 光標(biāo)記物質(zhì)，通過檢測每個熱循環(huán)后PCR反應(yīng)體系中的熒光值的變化情況來實時監(jiān)測DNA 的量變情況，并獲得每個樣本的熒光定量變化曲線，進而獲得每個反應(yīng)管的Ct值(熒光變 化達(dá)到閾值時的循環(huán)數(shù));同時，在相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下檢測2-10個倍數(shù)稀釋的已 知數(shù)量的靶標(biāo)DNA，獲得其Ct值，以起始模板數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn) 曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線和各個標(biāo)本的Ct值對每個反應(yīng)的起始DNA模板數(shù)進行定量測定。
[0004] SYBR Green是一種結(jié)合于雙鏈DNA小溝中的結(jié)合染料，與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光 大大增強，這種性質(zhì)使其應(yīng)用于擴增產(chǎn)物的檢測非常理想。SYBR Green的最大吸收波長約 為497 nm，發(fā)射波長最大約為520 nm。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR 熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而沒有摻入鏈中的SYBR染料分子不 會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
[0005] Northern blot技術(shù)可檢測基因的轉(zhuǎn)錄水平，但整個實驗過程操作比較復(fù)雜。 Northern blot實驗中一個主要的問題是RNA容易降解，所以Northern Blot中所有的實 驗用品都需要經(jīng)過除去RNA酶的過程，如高溫烘烤、DEPC處理等，這使實驗過程變得比較繁 瑣。另外，Northern Blot中很多實驗用品如甲醛、EB、DEPC、紫外燈等等對人體都有一定的 傷害。
[0006] 基因芯片技術(shù)實驗雖然降低了實驗人員的工作量，并可以在一次實驗中同時檢測 幾千個基因表達(dá)量變化，但是其靈敏度較低。
[0007] SYBR Green在核酸的實時檢測方面有很多優(yōu)點，由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié) 合，不必因為模板不同而特別定制，因此設(shè)計的程序通用性好，且價格相對較低。此外，由于 一個PCR產(chǎn)物可以與多分子的染料結(jié)合，因此SRYB Green的靈敏度很高。但是，由于SYRB Green與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴增產(chǎn)物引 起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光值的變化可以幫助降低非特異 產(chǎn)物對定量的影響。由解鏈曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBR Green得到的定 量結(jié)果。
[0008] 脂肪酸結(jié)合蛋白（Fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP)廣泛存在于動物的細(xì)胞 質(zhì)內(nèi)，是脂質(zhì)結(jié)合蛋白超家族成員，已發(fā)現(xiàn)9種類型的FABP，各種不同類型的脂肪酸結(jié)合 蛋白分布具有組織特異性，但都是對脂肪酸具有高親和力的可溶性蛋白質(zhì)。脂肪酸結(jié)合蛋 白 3 (Fatty Acid-Binding Protein 3, FABP3)又稱為心型脂肪酸結(jié)合蛋白（Heart Fatty Acid-Binding Protein 3, H-FABP)，主要在動物的心肌和骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)，是骨骼肌中 最主要的一類脂肪酸結(jié)合蛋白。FABP3的表達(dá)量與動物的肌間脂肪含量存在顯著的正相關(guān)， 因此，對動物FABP3基因的轉(zhuǎn)錄水平檢測有助于監(jiān)測其脂肪沉積的過程和解釋其機理。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種操作簡便、快速，且 能夠定量檢測不同牛種(包括奶牛、黃牛和牦牛）脂肪酸結(jié)合蛋白3 (Fatty Acid-Binding Protein 3, FABP3)基因轉(zhuǎn)錄水平的熒光定量PCR檢測試劑盒。
[0010] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：用于檢測牛FABP3基因轉(zhuǎn)錄水平 的引物對，是由引物一和引物二組成的，所述引物一如序列表中序列1所示，所述引物二如 序列表中序列2所示。
[0011] 本發(fā)明的第二個目的是提供了一種用于檢測牛FABP3基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑盒，包 括有以下試劑：2XSYBR GREENMIX、標(biāo)準(zhǔn)FABP3基因模板、上述的引物對和超純水。
[0012] 進一步的，上述的用于檢測牛FABP3基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑盒，所述試劑盒中， 2XSYBR GREEN MIX、標(biāo)準(zhǔn)FABP3基因模板、上述的引物對和超純水的配比為5mL :500 y L : 500 u L ：5mL〇
[0013] 進一步的，上述的用于檢測牛FABP3基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑盒，所述2 XSYBR GREEN MIX由以下試劑組成：Taq DNA聚合酶0? 1U/ y L、dNTPs底物0? 4 mmol/L、Mg2+ 5. Ommol/L、 KC1 100mmol/L、Tris.HCl 20mmol/L、明膠0.02%、SYBR Green染料。
[0014] 進一步的，上述的用于檢測牛FABP3基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑盒，所述標(biāo)準(zhǔn)FABP3基因 模板為序列表中序列3所示，標(biāo)準(zhǔn)FABP3基因模板的濃度為0. 8 y mol/L。
[0015] 進一步的，上述的用于檢測牛FABP3基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑盒，上述的引物對組成 的引物混合液中，引物一的濃度為8 ymol/L，引物二的濃度為8 ymol/L〇
[0016] 進一步的，上述的用于檢測牛FABP3基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑盒，所述超純水的純度 大于 18. 25 MQ. cm。
[0017] 本發(fā)明的第三個目的是提供了一種用于檢測牛FABP3基因轉(zhuǎn)錄水平的熒光定量 PCR檢測方法，包括以下步驟： 1) 配制熒光定量PCR反應(yīng)預(yù)混液：取2XSYBR GREEN MIX 1000 yL、上述的引物對組成 的引物混合液100 y L、超純水800 y L充分混勻，配制得到1900 y L的熒光定量PCR反應(yīng)預(yù) 混液； 2) 將步驟1)得到的熒光定量PCR反應(yīng)預(yù)混液按19 y L/管分裝成100個小管，加至熒 光定量專用PCR反應(yīng)管或反應(yīng)板中； 3) 配制10E-1、10E-2、10E-3、10E-4、10E-5系列稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)FABP3基因模板，以及未 稀釋的標(biāo)準(zhǔn)FABP3基因模板，共6種，每種10 y L，用于檢測基因的擴增效率； 4) 熒光定量PCR反應(yīng)擴增：每個裝有19 y L熒光定量PCR反應(yīng)預(yù)混液的反應(yīng)管或反應(yīng) 板中分別加入1 y L待測cDNA、作為陰性對照的超純水或作為陽性對照和計算擴增效率標(biāo) 準(zhǔn)的FABP3基因模板，震蕩混勻，瞬時離心后上機到熒光定量PCR儀中，95°C下變性30秒， 然后按95 °C 5秒，54. 6°C 20秒熱循環(huán)40次，并在54. 6°C時檢測記錄熒光信號； 5) PCR反應(yīng)結(jié)束后，讀取各個反應(yīng)的Ct值用以定量分析；同時于3%瓊脂糖凝膠進行 PCR產(chǎn)物電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)下觀察，灰度掃描分析記錄各PCR反應(yīng)的結(jié)果。
[0018] 進一步的，上述的用于檢測牛FABP3基因轉(zhuǎn)錄水平的熒光定量PCR檢測方法，所述 步驟4)中，裝有19 yL熒光定量PCR反應(yīng)預(yù)混液的100個小管中，其中1管加入作為陰性 對照的超純水、6管加入作為陽性對照和計算擴增效率標(biāo)準(zhǔn)的FABP3基因模板，其余小管加 入待測cDNA。
[0019] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的牛FABP3基因轉(zhuǎn)錄水平熒光定量PCR檢測試 劑盒，可以有效檢測不同牛種(包括奶牛、黃牛和牦牛)、不同組織、不同時期的FABP3基因的 mRNA表達(dá)狀態(tài)和表達(dá)量，同時可以鑒定該基因與動物脂肪沉積和肉品質(zhì)的相關(guān)性，以滿足 生命科學(xué)、動物醫(yī)學(xué)和動物科學(xué)研究者的檢測需要。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于： 1、本發(fā)明實現(xiàn)了方便快捷的檢測FABP3基因轉(zhuǎn)錄水平的目的；2、本發(fā)明在檢測基因轉(zhuǎn)錄水 平方面具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、實驗成本低的優(yōu)勢。
【附圖說明】
[0020] 圖1為FABP3基因轉(zhuǎn)錄水平熒光檢測結(jié)果的擴增曲線。
[0021] 其中，橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)為相對焚光量值（Relative Fluorescence Units，RFU)，擴增曲線結(jié)果表明FABP3基因