系統(tǒng)性紅斑狼瘡圖譜模型的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種獲取作為中間結(jié)果的系統(tǒng)性紅斑狼瘡信息，特別是涉及一種系統(tǒng) 性紅斑狼瘡圖譜模型的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE)是一種經(jīng)典的自身免疫 性疾病，以自身抗體產(chǎn)生、補體激活、免疫復(fù)合物沉積以及多種組織器官損傷為特征。SLE 的臨床表現(xiàn)多樣化，可以累積皮膚、腎臟、造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、肺臟、漿膜等多個組織和器 官的受累?；颊唧w內(nèi)存在多種免疫功能異常，如T細胞數(shù)量及功能減低；B細胞過度活化增 殖、產(chǎn)生多種自身抗體；免疫復(fù)合物清除功能障礙，補體系統(tǒng)缺陷；細胞凋亡異常和大量細 胞因子的產(chǎn)生引發(fā)體內(nèi)持續(xù)的自身反應(yīng)性炎癥，最終器官功能喪失，甚至死亡。
[0003] 為了闡明系統(tǒng)性紅斑狼瘡的致病機理，研究者從個體到細胞，從基因到蛋白，從遺 傳學(xué)到表觀調(diào)控進行了廣泛而深入的研究。由于系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種具臨床和血清學(xué)多 樣性的自身免疫性疾病，其復(fù)雜的發(fā)病機理和多樣化的臨床表現(xiàn)，很難用單一的生物學(xué)標(biāo) 志來說明SLE廣泛的特性，合適的生物學(xué)標(biāo)志物對于SLE進行早期診斷和精確評估預(yù)后及 治療效果具有重要價值。此前我們通過蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)尋找與SLE疾病相關(guān)的生物標(biāo) 志物，發(fā)現(xiàn)了一些潛在的有利用價值的生物標(biāo)志物。但由于SLE是多因素的、遺傳素質(zhì)、性 激素和環(huán)境因素相互作用引起自身免疫疾病，病變細胞和正常細胞之間無論在基因組還是 基因表達水平，蛋白組等方面的差別都不大。而且即使有差別，在外周血里面也很難察覺。 因此，從新的角度闡釋SLE的發(fā)病機制以及尋找新的生物標(biāo)志物仍然是當(dāng)前SLE研究的主 要目標(biāo)和挑戰(zhàn)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于此，有必要針對上述問題，提供一種系統(tǒng)性紅斑狼瘡圖譜模型的構(gòu)建方法。
[0005] -種系統(tǒng)性紅斑狼瘡圖譜模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0006] 設(shè)置系統(tǒng)性紅斑狼瘡組與正常對照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體 的外周血標(biāo)本；
[0007] 分別提取各所述外周血標(biāo)本中的DNA，得到DNA待測液；
[0008] 測定DNA待測液中DNA含量及完整性，檢測是否合格，是則執(zhí)行下一步驟；
[0009] 采用多重PCR技術(shù)，構(gòu)建基因文庫，并檢測所述基因文庫，檢測是否合格，是則執(zhí) 行下一步驟；
[0010] 采用高通量測序技術(shù)，對所述基因文庫進行測序；
[0011] 對測序結(jié)果進行分析，構(gòu)建系統(tǒng)性紅斑狼瘡圖譜模型。
[0012] 在其中一個實施例中，提取各所述外周血標(biāo)本中的DNA包括以下步驟：
[0013] 取5mL外周血加入至EDTA抗凝管；
[0014] 加入20mg/mL蛋白酶K 20 y 1，混合均勾，室溫放置15分鐘；
[0015] 加入200 y L結(jié)合液，充分混勻，再在70°C水浴放置10分鐘；
[0016] 加入100 y L異丙醇，混勾，得到混合液；
[0017] 將所述混合液加入吸附柱，然后將吸附柱放入收集管中，在轉(zhuǎn)速為lOOOOrpm的條 件下，離心30秒，棄廢液；
[0018] 加入500 y L抑制物去除液，在轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下，離心30秒，棄廢液；
[0019] 加700 y L漂洗液，在轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下，離心30秒，棄廢液；
[0020] 繼續(xù)加入500 y L漂洗液，在轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下，離心30秒，棄廢液；
[0021] 將吸附柱重新放回收集管中，在轉(zhuǎn)速為13000rpm的條件下，離心2分鐘，除去殘留 的漂洗液；
[0022] 將吸附柱放入一干凈離心管中，加100 y L已預(yù)熱的洗脫緩沖液，室溫放置3~5 分鐘，轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下，離心30秒，將得到的溶液重新加入吸附柱中，室溫放置2 分鐘，轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下，離心1分鐘；
[0023] 收集DNA并在2~8°C的環(huán)境中保存。
[0024] 在其中一個實施例中，測定DNA含量包括以下步驟：
[0025] 配制DNA染料工作液；
[0026] 制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0027] 將DNA待測液與DNA染料工作液混合，室溫靜置2分鐘后，進行熒光檢測；
[0028] 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得出DNA待測液的DNA含量。
[0029] 在其中一個實施例中，采用瓊脂糖凝膠電泳法測定DNA待測液的完整性。
[0030] 在其中一個實施例中，測定所述DNA待測液的完整性包括如下步驟：
[0031] 將DNA待測液與加樣緩沖液混合后加入孔板通電進行電泳，在電壓為120V的條件 下電泳45分鐘；
[0032] 取出凝膠，并在紫外燈下檢查。
[0033] 在其中一個實施例中，檢測所述基因文庫包括檢測所述基因文庫的插入片段范圍 及定量測定所述基因文庫的濃度。
[0034] 在其中一個實施例中，對所述測序結(jié)果進行分析包括：對所述測序數(shù)據(jù)進行預(yù)處 理、對所述測序數(shù)據(jù)進行比對分析及對所述測序數(shù)據(jù)的序列結(jié)構(gòu)進行分析。
[0035] 在其中一個實施例中，對所述測序數(shù)據(jù)進行預(yù)處理包括對所述測序數(shù)據(jù)進行過濾 處理。
[0036] 在其中一個實施例中，構(gòu)建基因文庫包括以下步驟：
[0037] 取適量DNA待測液，加入V區(qū)引物和J區(qū)引物進行多重PCR;
[0038] 電泳檢測回收PCR產(chǎn)物，得到第一樣本；
[0039] 取所述第一樣本補平末端，純化得到第二樣本；
[0040] 在所述第二樣本的3'端加A堿基，純化得到第三樣本；
[0041] 取3'末端具有T堿基的接頭與所述第三樣本連接，得到第四樣本；
[0042] 將所述第四樣本進行PCR擴增，電泳，切取目的片段后，純化回收，得到所述基因 文庫。
[0043] 在其中一個實施例中，所述適量DNA待測液中，DNA含量為500ng。
[0044] 上述系統(tǒng)性紅斑狼瘡圖譜模型的構(gòu)建方法，設(shè)計合理可行，能夠有效地獲取作為 中間結(jié)果的SLE相關(guān)信息，可用于SLE的后續(xù)分析，對這些信息進一步進行驗證分析和研究 將有助于SLE的原理分析，有助于揭示SLE的致病機制和疾病進程，對于SLE臨床診斷及病 情了解具有重要的意義，并為從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度探討SLE的發(fā)病機制及早期診斷提供新 思路和新依據(jù)。
【附圖說明】
[0045] 圖1為本發(fā)明一實施例中系統(tǒng)性紅斑狼瘡圖譜模型的構(gòu)建方法示意圖；
[0046] 圖2為SLE組和NC組中TRBV基因亞家族使用頻率的比較柱狀圖；
[0047] 圖3為SLE組和NC組中TRBJ基因亞家族使用頻率的比較柱狀圖。
【具體實施方式】
[0048] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明 的【具體實施方式】做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā) 明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不 違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施例的限制。
[0049] 例如，一種系統(tǒng)性紅斑狼瘡圖譜模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：設(shè)置系統(tǒng)性紅斑 狼瘡組與正常對照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體的外周血標(biāo)本；分別提取 各所述外周血標(biāo)本中的DNA，得到DNA待測液；測定DNA待測液中DNA含量及完整性，檢測 是否合格，是則執(zhí)行下一步驟；采用多重PCR技術(shù)，構(gòu)建基因文庫，并檢測所述基因文庫，檢 測是否合格，是則執(zhí)行下一步驟；采用高通量測序技術(shù)，對所述基因文庫進行測序；對測序 結(jié)果進行分析，構(gòu)建系統(tǒng)性紅斑狼瘡圖譜模型。
[0050] 請參閱圖1，本發(fā)明的一個實施例是，一種系統(tǒng)性紅斑狼瘡圖譜模型的構(gòu)建方法， 其包括如下步驟。
[0051]S110、設(shè)置系統(tǒng)性紅斑狼瘡組與正常對照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫 離人體的外周血標(biāo)本。
[0052] 例如，本發(fā)明各實施例采用兩組外周血標(biāo)本，分別來自10名系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者 和10名健康正常對照組，對應(yīng)作為SLE(系統(tǒng)性紅斑狼瘡）組與NC(正常對照）組。這兩組 全血標(biāo)本均來自中國廣西桂林第一八一醫(yī)院，所有患者均符合1997/1982年美國風(fēng)濕病學(xué) 院（ACR)和2012年系統(tǒng)性狼瘡國際協(xié)作組（SLICC)修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)。需要說明的是， 標(biāo)本收集的方案與執(zhí)行，均獲得廣西代謝性疾病重點實驗室和第一八一醫(yī)院倫理委員會的 批準(zhǔn)。
[0053] 例如，在室溫條件下，獲取脫離人體的外周靜脈血3mL置于5mLEDTA抗凝真空采 血管，蓋上蓋子后，將EDTA抗凝真空采血管輕輕顛倒混勻數(shù)次后，放入-80°C超低溫冰箱保 存?zhèn)溆谩?br>[0054] S120、分別提取各所述外周血標(biāo)本中的DNA，得到DNA待測液。
[0055] 例如，步驟S120具體包括以下步驟：
[0056] 取5mL外周血加入至10mLEDTA抗凝管中；
[0057] 加