表征溶酶體酶的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】表征溶酶體酶的方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)要求于2013年3月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/779, 767的優(yōu)先 權(quán)，所述臨時(shí)申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式并入本文。
[0003] 背景
[0004] 乙酰肝素N-硫酸酯酶（HNS)是與硫酸乙酰肝素降解有關(guān)的溶酶體酶。導(dǎo)致缺乏這 種酶的遺傳缺陷稱(chēng)為IIIA型粘多糖癥或A型圣菲力浦疾病。這種罕見(jiàn)常染色體隱性疾病在 活產(chǎn)新生兒中的發(fā)生率為1/24, 000,并且沒(méi)有被批準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)治療方法可用。目前在臨床上 正在評(píng)估酶替代療法（ERT)，其中將重組形式的外源酶引入受試者體內(nèi)以彌補(bǔ)由遺傳突變 導(dǎo)致的酶缺乏。具體地說(shuō)，可以將重組HNS酶引入診斷為A型圣菲力浦疾病患者體內(nèi)，以促 進(jìn)硫酸乙酰肝素的降解和生物轉(zhuǎn)換。為了進(jìn)行治療，通常使用基于細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生 重組HNS糖蛋白。通常，重組酶是包含5個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)以及若干用于翻譯后修飾 的附加位點(diǎn)的54. 7kDa糖蛋白。這些修飾結(jié)構(gòu)中的一些結(jié)構(gòu)，諸如帶有末端甘露糖-6-磷 酸者，對(duì)于生物功效來(lái)說(shuō)是重要的，而另一些可能在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和/或溶解性中有作用。 由此，受到上游細(xì)胞培養(yǎng)和下游純化過(guò)程兩者影響的存在于最終重組產(chǎn)品中的不同糖形的 多樣性可以對(duì)治療性酶的潛在功效、藥效學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)產(chǎn)生較大影響。
[0005] 因此商業(yè)環(huán)境中的重組蛋白質(zhì)治療劑的生產(chǎn)需要控制制造過(guò)程，所述制造過(guò)程涉 及一系列靈敏分析方法以闡明產(chǎn)品的生理化學(xué)特性和監(jiān)測(cè)其純度、穩(wěn)定性和/或活性。檢 測(cè)出純化的批次之間的細(xì)微的生理化學(xué)差異的能力對(duì)于實(shí)現(xiàn)受控的可靠生產(chǎn)過(guò)程以及一 致、安全且有效的產(chǎn)品是很重要的。
[0006]發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明特別提供改進(jìn)的方法來(lái)闡明重組乙酰肝素N-硫酸酯酶（HNS)蛋白質(zhì)的重 要生理化學(xué)特性，從而允許更有效地監(jiān)測(cè)和控制由商業(yè)制造過(guò)程生產(chǎn)的產(chǎn)品的質(zhì)量、純度 和穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明允許更可靠的生產(chǎn)過(guò)程以及用于對(duì)A型圣菲力浦疾病進(jìn)行有效的 酶替代療法的一致、安全且有效的產(chǎn)品?？深A(yù)料的是，本發(fā)明可適用于任何溶酶體酶。
[0008] 部分地，本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)：毛細(xì)管區(qū)帶電泳可以用于精確表征編碼與溶酶 體貯積病相關(guān)聯(lián)的酶的重組蛋白質(zhì)的生理化學(xué)特性。在一些具體實(shí)施方案中，重組蛋白質(zhì) 編碼HNS酶。可預(yù)料的是，溶酶體酶（S卩，HNS蛋白質(zhì)）的一種生理化學(xué)特性，分子電荷，是 一種特別重要的屬性。電荷微觀異質(zhì)性的程度可以歸因于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾（即，脫酰胺 作用）和/或連接至多肽鏈的碳水化合物部分。重要的是，分子電荷（即，帶電碳水化合物 結(jié)構(gòu)）的程度已經(jīng)顯示出在HNS蛋白質(zhì)的生物功效和血清半衰期以及蛋白質(zhì)抗原性、溶解 性和蛋白酶抗性方面具有重要影響。因此，重組溶酶體酶（如HNS)的天然電荷異質(zhì)性的定 量分析和表征是產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的重要部分。
[0009] 已知多種用于監(jiān)測(cè)天然電荷異質(zhì)性的不同分析技術(shù)，包括離子交換色譜法 (IEX-HPLC)、凝膠電泳等電聚焦（gel-IEF)、毛細(xì)管等電聚焦（cIEF)、成像cIEF和毛細(xì)管區(qū) 帶電泳（CZE)。雖然這些技術(shù)各自都提供優(yōu)點(diǎn)和劣勢(shì)，但是用于解決指定蛋白質(zhì)的電荷異質(zhì) 性的最佳方法將根據(jù)具體情況而確定。如下文實(shí)施例部分所描述的，本發(fā)明表明毛細(xì)管區(qū) 帶電泳特別適于表征溶酶體酶（如HNS)的天然電荷和聚糖分布，從而提供一定測(cè)定條件范 圍內(nèi)的高水平的再現(xiàn)性和穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明允許任何溶酶體酶的商業(yè)生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化和 最優(yōu)化。例如，這種方法可用于特別重組的HNS蛋白質(zhì)。雖然HNS蛋白質(zhì)用作實(shí)施例中描 述的CZE分析的實(shí)例，但是可以預(yù)料的是，本發(fā)明可以應(yīng)用于任何溶酶體酶。
[0010] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供分析溶酶體酶（如乙酰肝素N-硫酸酯酶蛋白質(zhì)）的方 法，其包括通過(guò)毛細(xì)管區(qū)帶電泳來(lái)表征酶的電荷分布。在一些實(shí)施方案中，溶酶體酶是重組 產(chǎn)生的。在一些實(shí)施方案中，表征步驟包括通過(guò)毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離對(duì)應(yīng)于電荷變化的峰 群的步驟。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，電荷分布包括少于14個(gè)對(duì)應(yīng)于電荷變體的存在的峰群。在一 些實(shí)施方案中，電荷分布包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個(gè)對(duì)應(yīng)于電荷變體的存 在的峰群。在一些實(shí)施方案中，電荷分布包括至少14個(gè)對(duì)應(yīng)于電荷變體的存在的峰群。在 一些實(shí)施方案中，電荷分布包括至少14、15、16、17、18、19、20或21個(gè)對(duì)應(yīng)于電荷變體的存 在的群。在一些實(shí)施方案中，峰群對(duì)應(yīng)于與唾液酸的不存在、存在或量改變相關(guān)聯(lián)的電荷變 體。在一些實(shí)施方案中，峰群對(duì)應(yīng)于與甘露糖6-磷酸（M6P)的不存在、存在或量改變相關(guān) 聯(lián)的電荷變體。在一些實(shí)施方案中，峰群對(duì)應(yīng)于與唾液酸和/或甘露糖6-磷酸的不存在、 存在或量改變相關(guān)聯(lián)的電荷變體。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，表征步驟包括定量地確定每個(gè)峰群的相對(duì)迀移時(shí)間。在一些 實(shí)施方案中，表征步驟包括定量地確定每個(gè)峰群的相對(duì)峰面積。在一些實(shí)施方案中，表征步 驟包括定量地確定每個(gè)峰群的相對(duì)迀移時(shí)間和/或相對(duì)峰面積。在一些實(shí)施方案中，相對(duì) 于電滲流（EOF)標(biāo)志物來(lái)確定每個(gè)峰群的相對(duì)迀移時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，使用超過(guò)一 個(gè)的EOF標(biāo)志物。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)與總峰面積比較的峰面積百分比來(lái)計(jì)算每個(gè)峰 群的相對(duì)峰面積。
[0013]在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括基于電荷分布來(lái)確定總唾液酸含量。在一些 實(shí)施方案中，所述方法還包括基于電荷分布來(lái)確定總甘露糖6-磷酸含量。在一些實(shí)施方案 中，所述方法還包括基于電荷分布來(lái)確定總唾液酸和/或甘露糖6-磷酸含量。在一些實(shí)施 方案中，確定唾液酸含量的方法包括確定單唾液酸化、雙唾液酸化和/或三唾液酸化聚糖 的不存在、存在或量。在一些實(shí)施方案中，確定M6P含量的方法包括確定單M6P和/或雙 M6P的不存在、存在或量。
[0014]在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括確定溶酶體酶（例如重組產(chǎn)生的HNS蛋白質(zhì)） 的質(zhì)量。在一些實(shí)施方案中，在制造生產(chǎn)開(kāi)始時(shí)確定蛋白質(zhì)的質(zhì)量。在一些實(shí)施方案中，在 生產(chǎn)期間一次或多次確定溶酶體酶的質(zhì)量。在一些實(shí)施方案中，在生產(chǎn)的不同階段和/或 步驟期間確定溶酶體酶的質(zhì)量。在一些實(shí)施方案中，確定溶酶體酶的質(zhì)量以監(jiān)測(cè)生產(chǎn)過(guò)程 中的進(jìn)展、變化和/或偏差。
[0015]在一些實(shí)施方案中，使用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)重組溶酶體酶蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施 方案中，溶酶體酶是HNS。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí) 施方案中，使用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人類(lèi)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，在微小規(guī)模生產(chǎn)速率下生 產(chǎn)重組溶酶體酶。在一些實(shí)施方案中，在中等生產(chǎn)規(guī)模下生產(chǎn)溶酶體酶。在一些實(shí)施方案 中，在大規(guī)模生產(chǎn)速率下生產(chǎn)溶酶體酶。
[0016]在一些實(shí)施方案中，所述方法包括確定在生產(chǎn)期間重組溶酶體酶（S卩，HNS)的電 荷分布是否存在變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在生產(chǎn)開(kāi)始時(shí)確定酶的電荷分布來(lái)鑒定電 荷分布的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在制造期間一次或多次確定酶的電荷來(lái)鑒定電荷 的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在生產(chǎn)結(jié)束時(shí)確定酶的電荷分布來(lái)鑒定電荷的變化。在 一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較在制造期間一次或多次收集的蛋白質(zhì)電荷分布來(lái)確定酶電荷分 布的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從使用相同制造方法生產(chǎn)的酶的一個(gè)或多個(gè)批次 收集的蛋白質(zhì)電荷分布來(lái)確定溶酶體酶電荷分布的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從 同一制造批次內(nèi)生產(chǎn)的酶的一個(gè)或多個(gè)小批收集的蛋白質(zhì)電荷分布來(lái)確定酶電荷分布的 變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從使用不同制造方法生產(chǎn)的酶的一個(gè)或多個(gè)批次收集 的蛋白質(zhì)電荷分布來(lái)確定酶電荷分布的變化。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，所述方法包括與參照相比，確定重組溶酶體酶的電荷分布是 否存在變化。在一些實(shí)施方案中，參照是與溶酶體1C積病相關(guān)聯(lián)的酶的電荷分布。在一些 實(shí)施方案中，參照是與溶酶體貯積病相關(guān)聯(lián)的一種或多種不同酶的平均電荷分布。在一些 實(shí)施方案中，參照是來(lái)自由不同商業(yè)批次生產(chǎn)的HNS蛋白質(zhì)的HNS電荷分布。在一些實(shí)施 方案中，參照是來(lái)自同一商業(yè)批次內(nèi)的兩個(gè)或多個(gè)不同小批的HNS蛋白質(zhì)測(cè)定的HNS電荷 分布。在一些實(shí)施方案中，參照是來(lái)自FDA批準(zhǔn)產(chǎn)品的HNS電荷分布。在一些實(shí)施方案中， 參照是由來(lái)自根據(jù)相同商業(yè)制造過(guò)程的一個(gè)或多個(gè)小批和/或批次所測(cè)定的HNS蛋白質(zhì)所 產(chǎn)生的平均HNS電荷分布。在一些實(shí)施方案中，參照是由來(lái)自根據(jù)不同商業(yè)制造過(guò)程的一 個(gè)或多個(gè)小批和/或批次所測(cè)定的HNS蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的平均HNS電荷分布。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在生產(chǎn)開(kāi)始時(shí)確定HNS的電荷分布來(lái)鑒定電荷分布的變 化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在制造期間一次或多次確定HNS的電荷來(lái)鑒定電荷的變化。在 一些實(shí)施方案中，通過(guò)在生產(chǎn)結(jié)束時(shí)確定HNS的電荷分布來(lái)鑒定電荷的變化。在一些實(shí)施 方案中，通過(guò)比較在制造期間一次或多次收集的HNS電荷分布來(lái)確定HNS電荷分布的變化。 在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從使用相同制造方法生產(chǎn)的HNS酶的一個(gè)或多個(gè)批次收集的 HNS電荷分布來(lái)確定HNS電荷分布的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從同一制造批次內(nèi) 生產(chǎn)的HNS酶的一個(gè)或多個(gè)小批收集的HNS電荷分布來(lái)確定HNS電荷分布的變化。在一些 實(shí)施方案中，通過(guò)比較從使用相同制造方法生產(chǎn)的HNS酶的一個(gè)或多個(gè)批次收集的HNS電 荷分布來(lái)確定HNS電荷分布的變化。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，所述方法包括與參照相比，確定重組溶酶體酶蛋白質(zhì)的電荷 同工型數(shù)目的變化。在一些實(shí)施方案中，參照是與溶酶體貯積病相關(guān)聯(lián)的酶的通過(guò)CZE獲 得的電荷同工型數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，參照是來(lái)自不同商業(yè)批次的通過(guò)CZE獲得的酶 電荷同工型數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，參照是來(lái)自同一商業(yè)批次內(nèi)的兩個(gè)或多個(gè)不同小批 的通過(guò)CZE獲得的平均酶電荷同工型數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，參照是來(lái)自FDA批準(zhǔn)產(chǎn)品 的酶電荷同工型數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，參照是由根據(jù)相同商業(yè)制造過(guò)程的一個(gè)或多個(gè) 小批和/或批次產(chǎn)生的平均酶電荷同工型數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，參照是由根據(jù)不同商 業(yè)制造過(guò)程的一個(gè)或多個(gè)小批和/或批次產(chǎn)生的平均酶電荷同工型數(shù)目。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，所述方法包括與參照相比，確定重組HNS蛋白質(zhì)的電荷同工 型數(shù)目的變化。在一些實(shí)施方案中，參照是與溶酶體貯積病相關(guān)聯(lián)的酶的通過(guò)CZE獲得的 電荷同工型數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，參照是來(lái)自不同商業(yè)批次的通過(guò)CZE獲得的HNS電 荷同工型數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，參照是來(lái)自同一商業(yè)批次內(nèi)的兩個(gè)或多個(gè)不同小批通 過(guò)CZE獲得的平均HNS電荷同工型數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，參照是來(lái)自FDA批準(zhǔn)產(chǎn)品的HNS電荷同工型數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，參照是由根據(jù)相同商業(yè)制造過(guò)程的一個(gè)或多個(gè)小 批和/或批次產(chǎn)生的平均HNS電荷同工型數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，參照是由根據(jù)不同商 業(yè)制造過(guò)程的一個(gè)或多個(gè)小批和/或批次產(chǎn)生的平均HNS電荷同工型數(shù)目。
[0021 ] 在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在生產(chǎn)開(kāi)始時(shí)確定酶的電荷分布來(lái)鑒定電荷同工型數(shù)目 的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在制造期間一次或多次確定酶的電荷同工型數(shù)目來(lái)鑒定 電荷的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在生產(chǎn)結(jié)束時(shí)確定酶的電荷同工型數(shù)目來(lái)鑒定電荷 的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較在制造期間一次或多次收集的酶的電荷同工型數(shù)目 來(lái)確定酶HNS電荷分布的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從使用相同制造方法生產(chǎn)的 酶的一個(gè)或多個(gè)批次收集的酶的電荷同工型數(shù)目來(lái)確定酶電荷分布的變化。在一些實(shí)施方 案中，通過(guò)比較從同一制造批次內(nèi)生產(chǎn)的酶的一個(gè)或多個(gè)小批收集的酶的電荷分布來(lái)確定 酶的電荷同工型數(shù)目的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從使用相同制造方法生產(chǎn)的酶 的一個(gè)或多個(gè)批次收集的酶的電荷分布來(lái)確定酶的電荷同工型數(shù)目的變化。
[0022] 在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括評(píng)估小批間電荷變化性的步驟。在一些實(shí)施 方案中，評(píng)估小批間電荷變化性的方法包括比較在制造批次期間生產(chǎn)的重組溶酶體酶蛋白 質(zhì)的每個(gè)小批的相對(duì)峰面積相對(duì)于峰群的趨勢(shì)圖。
[0023] 在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括評(píng)估批次間電荷變化性的步驟。在一些實(shí)施 方案中，評(píng)估批次間電荷變化性的方法包括比較每個(gè)由不同批次生產(chǎn)的重組溶酶體酶蛋白 質(zhì)的相對(duì)峰面積相對(duì)于峰群的趨勢(shì)圖。
[0024] 在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括評(píng)估生產(chǎn)方法電荷變化性的步驟。在一些實(shí) 施方案中，評(píng)估生產(chǎn)方法電荷變化性的方法包括比較每個(gè)由不同制造方法生產(chǎn)的重組溶酶 體酶蛋白質(zhì)的相對(duì)峰面積相對(duì)于峰群的趨勢(shì)圖。
[0025] 在一些實(shí)施方案中，毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE)在使得較長(zhǎng)的迀移時(shí)間對(duì)應(yīng)于增加負(fù) 電荷的物質(zhì)的條件下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，使用包含Tris的緩沖液進(jìn)行CZE。在一些 實(shí)施方案中，緩沖系統(tǒng)包含濃度在約20-30mM范圍內(nèi)的Tris。在一些實(shí)施方案中，緩沖系 統(tǒng)包含濃度為約25mM的Tris。在一些實(shí)施方案中，緩沖系統(tǒng)具有約7. 5-8. 5范圍內(nèi)的pH。 在一些實(shí)施方案中，緩沖系統(tǒng)具有約8. 0的pH。
[0026] 在一些實(shí)施方案中，使用裸露熔融石英毛細(xì)管柱進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE)。在一 些實(shí)施方案中，使用聚乙烯醇（PVA)涂布的毛細(xì)管柱進(jìn)行CZE。在一些實(shí)施方案中，使用長(zhǎng) 度在50-110cm之間的范圍內(nèi)的毛細(xì)管進(jìn)行CZE。在一些實(shí)施方案中，使用長(zhǎng)度為72cm的毛 細(xì)管進(jìn)行CZE。在一些實(shí)施方案中，使用長(zhǎng)度為104cm的毛細(xì)管進(jìn)行CZE。
[0027] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供分析溶酶體酶蛋白質(zhì)（如乙酰肝素N-硫酸酯酶）的 制造方法，其包括通過(guò)毛細(xì)管區(qū)帶電泳來(lái)表征酶的電荷分布。在一些實(shí)施方案中，表征步驟 包括通過(guò)毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離對(duì)應(yīng)于電荷變體的峰群的步驟。
[0028] 在一些實(shí)施方案中，電荷分布包括至少14個(gè)對(duì)應(yīng)于電荷變體的存在的峰群。在一 些實(shí)施方案中，電荷分布包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個(gè)對(duì)應(yīng)于電荷變體的存 在的峰群。在一些實(shí)施方案中，電荷分布包括至少14個(gè)對(duì)應(yīng)于電荷變體的存在的峰群。在 一些實(shí)施方案中，電荷分布包括至少14、15、16、17、18、19、20或21個(gè)對(duì)應(yīng)于電荷變體的存 在的峰群。在一些實(shí)施方案中，峰群對(duì)應(yīng)于與唾液酸的不存在、存在或量改變相關(guān)聯(lián)的電荷 變體。在一些實(shí)施方案中，峰群對(duì)應(yīng)于與甘露糖6-磷酸（M6P)的不存在、存在或量改變相關(guān) 聯(lián)的電荷變體。在一些實(shí)施方案中，峰群對(duì)應(yīng)于與唾液酸和/或甘露糖6-磷酸的不存在、 存在或量改變相關(guān)聯(lián)的電荷變體。
[0029] 在一些實(shí)施方案中，表征步驟包括定量地確定每個(gè)峰群的相對(duì)迀移時(shí)間。在一些 實(shí)施方案中，表征步驟包括定量地確定每個(gè)峰群的相對(duì)峰面積。在一些實(shí)施方案中，表征步 驟包括定量地確定每個(gè)峰群的相對(duì)迀移時(shí)間和/或相對(duì)峰面積。在一些實(shí)施方案中，每個(gè) 峰群的相對(duì)迀移時(shí)間相對(duì)于電滲流（EOF)標(biāo)志物來(lái)確定。在一些實(shí)施方案中，使用超過(guò)一 個(gè)EOF標(biāo)志物。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)與總峰面積比較的峰面積百分比來(lái)計(jì)算每個(gè)峰群 的相對(duì)峰面積。
[0030] 在一些實(shí)施方案中，所述制造方法還包括基于電荷分布來(lái)確定總唾液酸含量。在 一些實(shí)施方案中，所述制造方法還包括基于電荷分布來(lái)確定總甘露糖6-磷酸含量。在一些 實(shí)施方案中，所述制造方法還包括基于電荷分布來(lái)確定總唾液酸和/或甘露糖6-磷酸含 量。在一些實(shí)施方案中，確定唾液酸含量的制造方法包括確定單唾液酸化、雙唾液酸化和/ 或三唾液酸化聚糖的不存在、存在或量。在一些實(shí)施方案中，確定M6P含量的制造方法包括 確定單M6P和/或雙M6P的不存在、存在或量。
[0031] 在一些實(shí)施方案中，所述制造方法還包括確定生產(chǎn)的溶酶體酶蛋白質(zhì)的質(zhì)量。在 一些實(shí)施方案中，在制造生產(chǎn)開(kāi)始時(shí)確定酶的質(zhì)量。在一些實(shí)施方案中，在生產(chǎn)期間一次或 多次確定酶的質(zhì)量。在一些實(shí)施方案中，在生產(chǎn)的不同階段和/或步驟期間確定酶的質(zhì)量。 在一些實(shí)施方案中，確定酶的質(zhì)量以監(jiān)測(cè)生產(chǎn)過(guò)程中的進(jìn)展、變化和/或偏差。
[0032] 在一些實(shí)施方案中，使用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)重組溶酶體酶蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施 方案中，細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，使用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人類(lèi) 細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，在微小規(guī)模生產(chǎn)速率下生產(chǎn)重組溶酶體酶。在一些實(shí)施方案中， 在中等生產(chǎn)規(guī)模下生產(chǎn)溶酶體酶。在一些實(shí)施方案中，在大規(guī)模生產(chǎn)速率下生產(chǎn)溶酶體酶。 在某些具體實(shí)施方案中，溶酶體酶是HNS。
[0033] 在一些實(shí)施方案中，所述制造方法包括確定在生產(chǎn)期間重組溶酶體酶蛋白質(zhì)的電 荷分布是否存在變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在生產(chǎn)開(kāi)始時(shí)確定蛋白質(zhì)電荷分布來(lái)鑒定 電荷分布的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在制造期間一次或多次確定蛋白質(zhì)電荷來(lái)鑒定 電荷的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在生產(chǎn)結(jié)束時(shí)確定蛋白質(zhì)電荷分布來(lái)鑒定電荷的變 化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較在制造期間一次或多次收集的蛋白質(zhì)電荷分布來(lái)確定酶 電荷分布的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從使用相同制造方法生產(chǎn)的酶的一個(gè)或多 個(gè)批次收集的蛋白質(zhì)電荷分布來(lái)確定酶電荷分布的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較同 一制造批次內(nèi)生產(chǎn)的酶的一個(gè)或多個(gè)小批收集的蛋白質(zhì)電荷分布來(lái)確定酶電荷分布的變 化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從使用不同制造過(guò)程生產(chǎn)的酶的一個(gè)或多個(gè)批次收集的 蛋白質(zhì)電荷分布來(lái)確定酶電荷分布的變化。
[0034] 在一些實(shí)施方案中，所述制造方法包括與參照相比，確定重組溶酶體酶蛋白質(zhì)的 電荷分布是否存在變化。在一些實(shí)施方案中，參照是與溶酶體貯積病相關(guān)聯(lián)的酶的電荷分 布。在一些實(shí)施方案中，參照是與溶酶體貯積病相關(guān)聯(lián)的一種或多種不同酶的平均電荷分 布。在一些實(shí)施方案中，參照是來(lái)自通過(guò)不同商業(yè)批次生產(chǎn)的HNS蛋白質(zhì)的HNS電荷分布。 在一些實(shí)施方案中，參照是來(lái)自由同一商業(yè)批次內(nèi)的兩個(gè)或多個(gè)不同小批的HNS蛋白質(zhì)測(cè) 定的HNS蛋白質(zhì)的HNS電荷分布。在一些實(shí)施方案中，參照是來(lái)自FDA批準(zhǔn)產(chǎn)品的HNS電 荷分布。在一些實(shí)施方案中，參照是由來(lái)自根據(jù)相同商業(yè)制造過(guò)程的一個(gè)或多個(gè)小批和/ 或批次的所測(cè)定的HNS蛋白質(zhì)產(chǎn)生的平均HNS電荷分布。在一些實(shí)施方案中，參照是由來(lái) 自根據(jù)不同商業(yè)制造過(guò)程的一個(gè)或多個(gè)小批和/或批次的所測(cè)定的HNS蛋白質(zhì)產(chǎn)生的平均 HNS電荷分布。
[0035] 在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在生產(chǎn)開(kāi)始時(shí)確定HNS電荷分布來(lái)鑒定電荷分布的變 化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在制造期間一次或多次確定HNS電荷來(lái)鑒定電荷的變化。在 一些實(shí)施方案中，通過(guò)在生產(chǎn)結(jié)束時(shí)確定HNS電荷分布來(lái)鑒定電荷的變化。在一些實(shí)施方 案中，通過(guò)比較在制造期間一次或多次收集的HNS電荷分布來(lái)確定HNS電荷分布的變化。 在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從使用相同制造過(guò)程生產(chǎn)的HNS酶的一個(gè)或多個(gè)批次收集的 HNS電荷分布來(lái)確定HNS電荷分布的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從同一制造批次內(nèi) 生產(chǎn)的HNS酶的一個(gè)或多個(gè)小批收集的HNS的電荷分布來(lái)確定HNS電荷分布的變化。在一 些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從使用相同制造過(guò)程生產(chǎn)的HNS酶的一個(gè)或多個(gè)批次收集的HNS 電荷分布來(lái)確定HNS電荷分布的變化。
[0036] 在一些實(shí)施方案中，所述制造方法包括與參照相比，確定重組溶酶體酶蛋白質(zhì)的 電荷同工型數(shù)目的變化。在一些實(shí)施方案中，參照是與溶酶體貯積病相關(guān)聯(lián)的酶的通過(guò)CZE 獲得的電荷同工型數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，參照是來(lái)自不同商業(yè)批次的通過(guò)CZE獲得的 酶電荷同工型數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，參照是來(lái)自同一商業(yè)批次內(nèi)的兩個(gè)或多個(gè)不同小 批的通過(guò)CZE獲得的平均酶電荷同工型數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，參照是來(lái)自FDA批準(zhǔn)產(chǎn) 品的酶電荷同工型數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，參照是由根據(jù)相同商業(yè)制造過(guò)程的一個(gè)或多 個(gè)小批和/或批次產(chǎn)生的平均酶電荷同工型數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，參照是由根據(jù)不同 商業(yè)制造過(guò)程的一個(gè)或多個(gè)小批和/或批次產(chǎn)生的平均酶電荷同工型數(shù)目。
[0037] 在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在生產(chǎn)開(kāi)始時(shí)確定酶電荷分布來(lái)鑒定電荷同工型數(shù)目的 變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在制造期間一次或多次確定酶電荷同工型數(shù)目來(lái)鑒定電荷 的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在生產(chǎn)結(jié)束時(shí)確定酶電荷同工型數(shù)目來(lái)鑒定電荷的變化。 在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較在制造期間一次或多次收集的酶電荷同工型數(shù)目來(lái)確定HNS 電荷分布的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從使用相同制造過(guò)程生產(chǎn)的酶的一個(gè)或多 個(gè)批次收集的酶電荷同工型數(shù)目來(lái)確定酶電荷分布的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較 同一制造批次內(nèi)生產(chǎn)的酶的一個(gè)或多個(gè)批次收集的酶電荷分布來(lái)確定酶電荷同工型數(shù)目 的變化。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從使用相同制造過(guò)程生產(chǎn)的酶的一個(gè)或多個(gè)批次收 集的酶電荷分布來(lái)確定酶電荷同工型數(shù)目的變化。
[0038] 在一些實(shí)施方案中，所述制造方法還包括評(píng)估小批間電荷變化性的步驟。在一些 實(shí)施方案中，評(píng)估小批間電荷變化性的方法包括比較在制造批次期間生產(chǎn)的溶酶體酶蛋白 質(zhì)的每個(gè)小批的相對(duì)峰面積相對(duì)于峰群的趨勢(shì)圖。
[0039] 在一些實(shí)施方案中，所述制造方法還包括評(píng)估批次間電荷變化性的步驟。在一些 實(shí)施方案中，評(píng)估批次間電荷變化性的方法包括比較每個(gè)由不同批次生產(chǎn)的溶酶體酶蛋白 質(zhì)的相對(duì)峰面積相對(duì)于峰群的趨勢(shì)圖。
[0040] 在一些實(shí)施方案中，所述制造方法還包括評(píng)估生產(chǎn)方法電荷變化性的步驟。在一 些實(shí)施方案中，評(píng)估生產(chǎn)方法電荷變化性的方法包括比較每個(gè)由不同制造過(guò)程生產(chǎn)的溶酶 體酶蛋白質(zhì)的相對(duì)峰面積相對(duì)于峰群的趨勢(shì)圖。
[0041] 在一些實(shí)施方案中，毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE)在使得較長(zhǎng)的迀移時(shí)間對(duì)應(yīng)于增加負(fù) 電荷的物質(zhì)的條件下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，使用包含Tris的緩沖液進(jìn)行CZE。在一些 實(shí)施方案中，緩沖系統(tǒng)包含濃度在約20-30mM范圍內(nèi)的Tris。在一些實(shí)施方案中，緩沖系 統(tǒng)包含濃度為約25mM的Tris。在一些實(shí)施方案中，緩沖系統(tǒng)具有約7. 5-8. 5范圍內(nèi)的pH。 在一些實(shí)施方案中，緩沖系統(tǒng)具有約8. 0的pH。
[0042] 在一些實(shí)施方案中，使用裸露熔融石英毛細(xì)管柱進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE)。在一 些實(shí)施方案中，使用聚乙烯醇（PVA)涂布的毛細(xì)管柱進(jìn)行CZE。在一些實(shí)施方案中，使用長(zhǎng) 度在50-llOcm之間的范圍內(nèi)的毛細(xì)管進(jìn)行CZE。在一些實(shí)施方案中，使用長(zhǎng)度在72-104cm 范圍內(nèi)的毛細(xì)管進(jìn)行CZE。
[0043] 在一些實(shí)施方案中，所述制造方法還包括基于電荷分布的分析來(lái)調(diào)節(jié)制造條件的 步驟。在一些實(shí)施方案中，分析步驟在純化前進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，分析步驟在純化期 間進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，分析步驟在制造過(guò)程期間進(jìn)行一次或多次。在一些實(shí)施方案 中，分析步驟在釋放一定批量用于商業(yè)銷(xiāo)售前進(jìn)行。