一種從千層塔中提取石杉堿甲的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術領域的提取方法，具體說是一種從千層塔中提取石杉堿甲的方法。
【背景技術】
[0002]千層塔為石杉科石杉屬蕨類植物，又名蛇足石杉、救命王。多年生草本，全株暗綠色，高15?40厘米。根須狀。莖直立或下部平臥，頂端常具生殖芽，落地成新苗。葉紙質(zhì)，橢圓狀披針形。孢子囊腎形，橫生葉腋，兩端超出葉緣，淡黃色，全株上下均有。主布東北、長江流域和閩、粵、桂、滇、黔等省區(qū)。民間常將全草入藥，有毒，用于退熱、止血、消腫散毒、跌打損傷等。在中國南方，民間用石松類全草治療風濕麻痹、跌打損傷、發(fā)熱等癥。1881年，Bodeker從L.compIanatum分離得到了第一個石松生物堿；自1986年劉嘉森從石松類植物蛇足石杉〔Huperzia seratta(Thunb), Trev (Huperziaceae)〕中分離得到了石杉喊甲以來，石杉堿甲成為藥學界持續(xù)研究的熱點之一。
[0003]石杉堿甲(HuperzineA)為可逆的、高選擇性的、低毒性的膽堿酷酶抑制劑，可以增加大腦中的乙酞膽堿含量，有恢復和增強記憶的療效，為我國首創(chuàng)的治療良性記憶障礙和阿爾茨海默氏癡呆的藥物，療效高于他克林，毒扁豆堿和加蘭他敏。國內(nèi)用于治療老年癡呆的石杉堿甲新藥“雙益平”和“哈伯因”已經(jīng)成功生產(chǎn)上市。石杉堿甲對有機磷中毒，以及重癥肌無力癥治療也有顯著療效。石杉堿甲易透過血腦屏障，口服生物利用度高，作用時間長的特點，無嚴重不良反應，在國際上已被列為第二代膽堿酷酶的抑制劑，是目前國內(nèi)外上述病癥最有效的藥物。
[0004]傳統(tǒng)的石杉堿甲分離方法有酒石酸浸泡、鹽酸滲流，Soxhlet抽提以及用乙醇回流提取、硅膠柱層析等，這些方法缺點是耗時、有機試劑用量多、得率低以及雜質(zhì)較多。鹽酸滲流法以生藥粗粉用2% HCl滲流，繼而以陽離子樹脂交換，所得總堿用硅膠柱層析低壓分離，再以乙醇-冰醋酸洗脫。按色帶不同分成6部分，不同部分再進一步分離，利用制備性薄層層析分離得到石杉堿甲。此法步驟繁瑣，使用的試劑較多，成本高，得率低，不適合工業(yè)化，只適用于實驗室少量分離。乙醇提取法是以95%的乙醇浸泡提取石松生物堿，再以稀NaOH溶液萃取，所得的酚性生物堿再以堿性硅膠柱層析，接著用氯仿-甲醇洗脫，各流份以薄層層析檢查，最后用丙酮進行重結(jié)晶得到石杉堿甲晶體。此法提取分離石杉堿甲相對來說工藝流程縮短了，但是提取不完全，得率低，費用高。沈生榮等用氯仿制成總堿浸膏再用鹽酸進行萃取的方法分離得到石杉堿甲。查圣華，李秀男等利用微波協(xié)助提取及超聲提取石杉堿甲等法，與傳統(tǒng)提取方法相比有固液分離次數(shù)少，處理時間短，操作簡便；溶劑耗量少，成本低；選擇性好，雜質(zhì)較少；能量傳輸效果好等優(yōu)點，但是費用高，不便用于產(chǎn)業(yè)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種從千層塔中提取石杉堿甲的方法，具有工藝簡單，適合生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。
[0006]本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)，具體包括如下步驟:
[0007]I)浸泡處理:將千層塔裝入編織袋，扎好口，放在水池里，水池加滿水，并在水池上面壓上重物，浸泡；
[0008]2)原料處理:將步驟I)得到的千層塔粉碎至20-40目，加入相當于原料2_3倍重量的純凈水，加熱至50-60°C維持5-10分鐘，得到膏狀漿液；
[0009]3)酶解:將步驟2)得到的膏狀漿液，調(diào)pH為4-5，加入膏狀漿液0.05-0.1%重量份的果膠-纖維素復合酶和0.001重量份的甘露醇進行酶解40-60分鐘，得到酶解液；
[0010]4)去油:將步驟3)得到的酶解液，加入2-3倍重量的純凈水，加熱至60-70°C浸提60-120分鐘，得上層浮油液與下層液、渣混合物，分離；
[0011]5)酸解:將步驟4)得到的下層液、渣混合物，用硫酸調(diào)pH為2-3，加熱至50_60°C維持6-8小時；
[0012]6)萃取:向步驟5)得到的酸解液中加入氨水，調(diào)pH為8-9，加入氯仿進行萃取，然后將氯仿萃取液濃縮得浸膏；
[0013]7)柱層析:將步驟6)得到的浸膏，用20-30%乙醇(v/v)溶解，用腈基鍵合硅膠樹脂反相層析，用40%乙醇(v/v)進行洗脫，收集洗脫液，回收乙醇至無醇味；
[0014]8)重結(jié)晶:向步驟7)得到的洗脫液中加入丙酮進行重結(jié)晶，洗滌，干燥得石杉堿甲。
[0015]本發(fā)明步驟I)所述的浸泡，時間優(yōu)選15-24小時。
[0016]步驟3)所述的果膠-纖維素復合酶，優(yōu)選活性是1-3萬活性單位/克(毫升)的固態(tài)或液態(tài)果膠-纖維復合酶。
[0017]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點:
[0018]1、千層塔的植物細胞內(nèi)含有大量的油脂，主要由成分為甘油三酯的化合物組成的混合物，這些油脂以油粒和油體原生質(zhì)體形式、呈不連續(xù)顆粒狀、與顆粒蛋白體一起無規(guī)則地分散在細胞內(nèi)等存在形式存在?，F(xiàn)有的提取方法，都是直接對千層塔等原料打碎或粉碎后通過水提/醇提、酶解、或者微波提取等方式直接提取，在提取的時候，細胞中的油脂會同時分離出，含有油脂的基團和石杉堿甲等生物堿混在一起，從而影響后續(xù)有效成分的分離，增加了工序的處理難度。本發(fā)明先采用酶提取植物油脂，利用非油成分對油和水的親和力差異及油水比重不同而將油和非油成分分離，增加了產(chǎn)品收率和提高了提取率。
[0019]2、本發(fā)明采用千層塔水池浸泡，千層塔浸泡在水里，千層塔逐漸軟化，水分自然進入到內(nèi)部，利于植物油脂的分離，利于后續(xù)酶解、去油；同時，千層塔浸泡在水里，厭氧細菌大量繁殖，特別是夏天的時候，會變酸，PH值會下降，方便后面工序的調(diào)整pH。
[0020]3、本發(fā)明先采用果膠-纖維素復合酶去除細胞壁，釋放植物細胞中的油脂，加入甘露醇，可以保持滲透壓，利于油脂的釋放。
[0021 ] 4、本發(fā)明得到的石杉堿甲，經(jīng)HPLC檢測，含量在99 %以上，收率90 %以上。
【具體實施方式】
[0022]下面以實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不局限于這些實施例。
[0023]實施例1:
[0024]—種從千層塔中提取石杉堿甲的方法，具體包括如下步驟:
[0025]I)浸泡處理:將千層塔裝入編織袋，扎好口，放在水池里，水池加滿水，并在水池上面壓上重物，浸泡15小時；
[0026]2)原料處理