一類核苷類抗生素及其在制備抗菌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物和海洋微生物代謝工程領(lǐng)域，具體涉及一類核苷類抗生素及 其在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 在過(guò)去的十年間，海洋放線菌已成為新穎生物活性天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)的新源泉。例 如，Salinispora屬放線菌，可產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)新穎和生物活性廣泛的化合物，如海洋放線 菌Salinispora tropica可產(chǎn)生化合物salinosporamide A，作為高效的蛋白酶體抑制劑 該化合物已經(jīng)進(jìn)入癌癥治療的臨床試驗(yàn)了。本研究單位（中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所） 從中國(guó)南海北部深海海溝的沉積土里分離得到一個(gè)放線菌新屬菌種Marinactinospora thermotolerans SCSI000652,該菌株生產(chǎn)核苷類抗生素 A201A，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有顯著 抑制作用。
[0003] 與抗生素生物合成相關(guān)的基因往往成簇排列，包括自我抵抗基因、轉(zhuǎn)運(yùn)基因和調(diào) 控基因?？股厣锖铣苫虼爻晒寺『?，可利用分子生物學(xué)基礎(chǔ)上的組合生物合成 (combinatorial biosynthesis)和代謝工程（metabolic engineering)技術(shù)來(lái)定向創(chuàng)造新 結(jié)構(gòu)、新活性化合物，這無(wú)疑將大大豐富已有的資源，從而為解決或部分解決臨床上病原微 生物的耐藥性日益嚴(yán)重的問(wèn)題。
[0004] 近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的PCR-Targeting技術(shù)和接合轉(zhuǎn)移技術(shù)已在多種鏈霉菌中成功 應(yīng)用。PCR-Targeting技術(shù)是以RED重組技術(shù)為基礎(chǔ)的，RED同源重組系統(tǒng)由源于λ噬菌 體的exo、bet、gam基因組成，在這3個(gè)基因產(chǎn)物的作用下，該系統(tǒng)能介導(dǎo)36bp以上的同源 片段產(chǎn)生同源重組。接合轉(zhuǎn)移技術(shù)是發(fā)生在大腸桿菌與鏈霉菌之間，可以避開(kāi)胞外核酸酶 的影響，使DNA免遭核酸酶的降解，在某種程度上可以克服宿主對(duì)外源DNA的限制性修飾 從而提高轉(zhuǎn)化效率，而且操作程序簡(jiǎn)單，因此應(yīng)用較為廣泛。PCR-Targeting技術(shù)和接合轉(zhuǎn) 移技術(shù)為通過(guò)基因工程對(duì)鏈霉素中抗生素生物合成基因簇進(jìn)行遺傳改造提供了一種方便 而有效的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一類具有抑菌作用的核苷類抗生素。
[0006] 本發(fā)明的核苷類抗生素或其藥用鹽，其結(jié)構(gòu)式如式（I )或式（II )所示：
[0007]
[0008] 式（I )中，化合物 I :R1 = H，R2 = OMe，R3 = OMe，R4 = H，X = H ;化合物 2 :R1 =Me，R2 = OH，R3 = OMe，R4 = H，X = H ;化合物 3 :R1 = Me，R2 = OMe，R3 = OH，R4 = H， X = H ;化合物 4 :R1 = Me，R2 = OMe，R3 = OMe，R4 = OH，X = H ;化合物 5 :R1 = Me，R2 = OMe，R3 = OMe，R4 = H，X = F ;化合物 6 :R1 = Me，R2 = OMe，R3 = OMe，R4 = H，X = Cl ;
[0009] 式（II )中，化合物 7 :R = OMe ;化合物 8 :R = OH。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述核苷類抗生素或其藥用鹽在制備抗菌藥物中的 應(yīng)用。
[0011] -種抗菌藥物，其特征在于，包括有效量的作為活性成份的上述核苷類抗生素或 其藥用鹽，和藥學(xué)上可以接受的載體。
[0012] 優(yōu)選，所述的抗菌藥物為抗金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金 芽孢桿菌的藥物。
[0013] 進(jìn)一步優(yōu)選，當(dāng)為化合物5或6時(shí)，所述的抗菌藥物為抗金黃色葡萄球菌、藤黃微 球菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌的藥物。
[0014] M. thermotolerans SCSIO 00652 突變株 00652-Δ 1 在制備化合物 1 中的應(yīng) 用，所述的 M. thermotolerans SCSIO 00652 突變株 00652-Δ 1 是 mtdMl 基因失活的 M. thermotolerans SCSI000652〇
[0015] M. thermotolerans SCSIO 00652 突變株 00652-Δ2 在制備化合物 2 中的應(yīng) 用，所述的 M. thermotolerans SCSIO 00652 突變株 00652- Δ 2 是 mtdM2 基因失活的 M. thermotolerans SCSI000652〇
[0016] M. thermotolerans SCSIO 00652 突變株 00652-Δ3 在制備化合物 3 中的應(yīng) 用，所述的 M. thermotolerans SCSIO 00652 突變株 00652- Δ 3 是 mtdM3 基因失活的 M. thermotolerans SCSI000652〇
[0017] M. thermotolerans SCSIO 00652 突變株 00652-Δ4 在制備化合物 4 中的應(yīng) 用，所述的M. thermotolerans SCSIO 00652突變株00652-Δ 4是mtdH基因失活的 M. thermotolerans SCSI000652〇
[0018] M. thermotolerans SCSIO 00652 突變株 00652-Δ 5 在制備化合物 5 和 / 或 6 中 的應(yīng)用，所述的Mthermotolerans SCSIO 00652突變株00652-Δ 5是mtdV基因失活的 M.thermotolerans SCSIO 00652〇
[0019] M. thermotolerans SCSIO 00652 突變株 00652-Δ7 在制備化合物 7 中的應(yīng) 用，所述的M. thermotolerans SCSIO 00652突變株00652-Δ 7是mtdW基因失活的 M. thermotolerans SCSI000652〇
[0020] M. thermotolerans SCSIO 00652突變株00652-Δ 8在制備化合物8中的應(yīng)用，所 述的 Μ. thermotolerans SCSIO 00652 突變株 00652-Δ 8 是 mtdW基因和 mtdM4 基因失活的 M.thermotolerans SCSIO 00652〇
[0021] 本發(fā)明提供了一類具有抗菌活性的核苷類抗生素化合物1-8,從而為研制新的抗 菌藥物提供了新的先導(dǎo)化合物，對(duì)開(kāi)發(fā)中國(guó)海洋藥物資源具有重要的意義。
[0022] 用于本發(fā)明的 M. thermotolerans SCSIO 00652 已經(jīng)在專利號(hào)：ZL201110340905. X，發(fā)明名稱為一種核苷類抗生素 A201A高產(chǎn)菌株及其構(gòu)建方法中公開(kāi)了。
【具體實(shí)施方式】：
[0023] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0024] 實(shí)施例 I :M. thermotolerans SCSIO 00652 突變株 00652-Δ 1 等突變株的構(gòu)建
[0025] Μ. thermotolerans SCSIO 00652 能夠產(chǎn)生核苷類抗生素 Α201Α，Α201Α 生物合成 基因簇的DNA序列已儲(chǔ)存在GenBank中，其注冊(cè)號(hào)為JN651966。
[0026] 突變株是采用了 λ-RED介導(dǎo)的PCR-Targeting技術(shù)和接合轉(zhuǎn)移技術(shù)。構(gòu)建 M. thermotolerans SCSIO 00652 突變株 00652-Δ 1 的流程如下：
[0027] 1.從基因組文庫(kù)中篩選包含核苷類抗生素 Α201Α生物合成基因的克隆，其中編號(hào) 為142Η的克隆包含核苷類抗生素 Α201Α全部的基因簇序列，被用于突變株的構(gòu)建。
[0028] 2.將142Η粘粒轉(zhuǎn)化入E.coli BW25113/pIJ790中，由此得到細(xì)胞命名為： BW25113/pIJ790/142H〇
[0029] 3.以EcoRI和HindIII雙酶切過(guò)的pIJ773質(zhì)粒為模板，用mtdMl基因突變引物 (MldF :5' -gccacggaggtcatggcgtcggcccttccctaccctgtcATTCCGGGGATCCGTCGAC-3' ；MldR : 5' -gtccccggccagccgttccagcagcgcgccgtcggcgagTGTAGGCTG GAGCTGCTTC-3'，小寫(xiě)字母代 表與mtdMl基因同源）進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，切膠回收阿普拉霉素（Apramycin，Apr)抗性片 段并轉(zhuǎn)化 BW25113/pIJ790/142H細(xì)胞中，用 LB+Kan (終濃度 50 μ g/mL) +Apr (終濃度 50 μ g/ mL)篩選陽(yáng)性克隆，得到篩選到的重組粘粒。
[0030] 4.篩選到的重組粘粒用驗(yàn)證引物（MltF :5'-AGTACGACACCCGATCACGA-3' ；MltR : 5'-GAGCTGGTGCGGATGATGGT-3'）進(jìn)行PCR進(jìn)行驗(yàn)證，如能夠擴(kuò)增出1905bp片段則為正確。隨 后，將驗(yàn)證過(guò)的重組粘粒轉(zhuǎn)化E. coli ET12567/pUZ8002,得到包含重組粘粒的菌株E. coli ET12567/pUZ8002。
[0031] 5.接合轉(zhuǎn)移：將野生型M. thermotolerans SCSIO 00652的菌絲體在TSB培養(yǎng) 液中，28 °C震蕩培養(yǎng)1~2天，累計(jì)生物量；將包含重組粘粒的菌株E. coli ET12567/ PUZ8002在含有卡那霉素（Kan，終濃度50 μ g/mL)、氨芐青霉素（Amp，終濃度100 μ g/mL)、 氯霉素（Cml，終濃度25 μ g/mL)和Apr (終濃度50 μ g/mL)的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至光密度 值OD = 0. 6,離心收集細(xì)胞，用不添加抗生素的LB培養(yǎng)基洗滌兩次，然后與離心后收集的 野生型M. thermotolerans SCSIO 00652菌絲體進(jìn)行混合，混合液平鋪在加有IOmM MgS04 的M-ISP4固體培養(yǎng)基（在ISP4培養(yǎng)基上加有0. 1%蛋白胨、0.05%酵母提取物和3%海 鹽）上；在28°C生長(zhǎng)20小時(shí)后，每個(gè)固體培養(yǎng)基平板上涂布800 μ L加有抗生素藥物的 無(wú)菌水，其中含抗生素藥物：甲氧節(jié)氨啼啶（Tmp, 50mg/mL) 30 μ L，Apr (50mg/mL) 20 μ L ;讓 其在37°C培養(yǎng)箱下生長(zhǎng)2-4天，直到接合子出現(xiàn)；接合子在不加抗生素的M-ISP4固體培 養(yǎng)基平板上連續(xù)傳代3代后，挑選表型為Kan sAprR (即耐受Apr，不耐受Kan)的接合子，提 取基因組DNA，用驗(yàn)證引物（MltF和MltR)進(jìn)行PCR，如PCR產(chǎn)物僅有1905bp突變帶，而無(wú) 野生帶則表明接合子即為mtdMl被突變的突變株00652-Δ 1，由此得到MtdMl基因失活的 M. thermotolerans SCSIO 00652 突變株 00652-Δ 1〇
[0032] 本發(fā)明中的其他突變株的構(gòu)建方法與M. thermotolerans SCSIO 00652突變株 00652-Δ 1類似，突變引物和驗(yàn)證引物見(jiàn)表1。
[0033] 由此得到 M. thermotolerans SCSIO 00652 突變株 00652-Δ 1 (對(duì) mtdMl 基因進(jìn) 行突變，使其失活，該mtdMl基因的核苷酸序列已經(jīng)存入GenBank，其是登陸號(hào)為：JN651966 的 12136-12840 位堿基所示）、E thermotolerans SCSIO 00652 突變株 00652-Δ2(對(duì) mtdM2基因進(jìn)行突變，使其失活，該mtdM2基因的核苷酸序列已經(jīng)存入GenBank，其是登 陸號(hào)為：JN651966 的 31045-32109 位堿基所示）、M. thermotolerans SCSIO 00652 突變 株00652- △ 3 (對(duì)mtdM3基因進(jìn)行