植物淀粉合成相關(guān)蛋白IbSSI及其編碼基因與應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物淀粉合成相關(guān)蛋白IbSSI及其編碼 基因與應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘薯（Ipomoea batatas (L. ) Lam.)是一種重要的糧食、飼料以及工業(yè)原料用作物， 并且在當今世界上作為一種新型能源植物，其地位顯得尤為重要。我國是世界上最大的甘 薯生產(chǎn)國，年種植面積348. 2萬公頃，占世界總種植面積的43. 0%，年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的 68. 6%。我國目前正處于飛速發(fā)展時期，對能源的需求持續(xù)增加，因此尋找新的可替代能源 將是一項長期的戰(zhàn)略性工作。甘薯作為一種塊根作物，含豐富的淀粉，而淀粉又是目前工業(yè) 乙醇生產(chǎn)的重要原料之一，因此通過對甘薯淀粉生物合成途徑相關(guān)蛋白的深入研究，提高 甘薯淀粉總含量與品質(zhì)，對于增加甘薯在新能源領(lǐng)域的應用價值非常有意義。
[0003] 甘薯是無性繁殖作物，種間、種內(nèi)雜交不親和性嚴重限制了甘薯育種中的資源利 用和親本自由組配，育種實踐表明，用常規(guī)雜交育種方法難以選育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、耐鹽抗旱 的甘薯新品種。利用基因工程技術(shù)培育甘薯新品種，可以減少甘薯種質(zhì)的退化，提高甘薯的 產(chǎn)量和品質(zhì)，具有較好的環(huán)境效益和社會效益。
[0004] 植物淀粉是大多數(shù)植物種子或塊莖的主要組成部分，在人類生活中起著舉足輕重 的作用。植物淀粉主要是由兩類葡糖聚體組成：（1)直鏈淀粉，由1000-5000個葡糖殘基以 α -1，4糖苷鍵呈線性連接的葡聚糖直鏈，很少或沒有α -1，6糖苷鍵分支；（2)支鏈淀粉， 由線性的α-1，4葡聚糖苷鏈在α-1，6糖苷鍵部位產(chǎn)生葡聚糖分支構(gòu)成的一束葡糖聚體 (polymerization，DP)，分子量大約在IO 5-IO6葡糖殘基單位左右。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何提高植物淀粉的總含量和/或改變淀粉品質(zhì)。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了一種植物淀粉合成相關(guān)蛋白。
[0007] 本發(fā)明所提供的植物淀粉合成相關(guān)蛋白，名稱為IbSSI，來源于甘薯（Ipomoea batatas (L.) Lam.)，是如下1)或2)或3)的蛋白質(zhì)：
[0008] 1)氨基酸序列是序列表序列2所示的蛋白質(zhì)；
[0009] 2)在序列表序列2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)；
[0010] 3)將1)或2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加得到的與植物淀粉合成相關(guān)的蛋白質(zhì)。
[0011] 其中，序列表序列2由657個氨基酸殘基組成。
[0012] 為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧 基末端連接上如表1所示的標簽。
[0013] 表1、標簽的序列
[0014]
[0015] 上述c)中的蛋白質(zhì)IbSSI，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0016] 上述c)中的蛋白質(zhì)IbSSI可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達 得到。
[0017] 上述c)中的蛋白質(zhì)IbSSI的編碼基因可通過將序列表序列1所示的DNA序列中 缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在 其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
[0018] 編碼所述IbSSI的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0019] 所述編碼IbSSI的核酸分子可為如下（1)或⑵或（3)或（4)所示的DNA分子：
[0020] (1)核苷酸序列是序列表序列1所示的DNA分子；
[0021] (2)編碼區(qū)如序列表序列1所示的DNA分子；
[0022] (3)與⑴或⑵限定的核苷酸序列具有80%或80%以上同一性，且編碼所述 IbSSI的DNA分子；
[0023] (4)在嚴格條件下與⑴或（2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述IbSSI的DNA 分子。
[0024] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也 可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0025] 其中，序列表序列1由1974個核苷酸組成，序列表序列1的核苷酸編碼序列表序 列2所示的氨基酸序列。
[0026] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方 法，對本發(fā)明的編碼IbSSI的核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分 離得到的IbSSI的核苷酸序列80%或者更高同一性的核苷酸，只要編碼IbSSI且與植物淀 粉合成相關(guān)，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0027] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本發(fā) 明的編碼序列表的序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有80%或更高， 或85 %或更高，或90 %或更高，或95 %或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或 計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比（％) 表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。
[0028] 含有所述編碼所述IbSSI的核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因 細胞系也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0029] 所述表達盒可為表達盒A ;所述表達盒A包括啟動子、編碼所述IbSSI的核酸分子 和終止子。所述啟動子可為CaMV35S啟動子、NOS啟動子或OCS啟動子；所述終止子可為 NOS終止子或OCS polyA終止子。
[0030] 所述表達盒A的序列可為序列表序列3所示。所述表達盒A中：序列表序列3的 自5'末端第1至835位為CaMV35S啟動子，第848至2821位為編碼所述IbSSI的核酸分 子，第2838至3090位為NOS終止子。
[0031] 所述重組載體可為將所述IbSSI的編碼基因（即序列表序列1所示的DNA分子） 通過含有所述IbSSI的編碼基因的表達盒插入出發(fā)質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒。
[0032] 所述重組載體可為用序列表序列1所示的DNA分子替換pCAMBIA3301的XbaI 和SacI識別序列間的片段（pCAMBIA3301被限制性核酸內(nèi)切酶XbaI和SacI切成一 個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段）得到的重組載體pCAMBIA3301-IbSSI， PCAMBIA3301-IbSSI表達序列表序列2所示的IbSSI。所述pCAMBIA3301與 pCAMBIA3301-IbSSI的差別僅在于將pCAMBIA3301的XbaI和SacI識別序列間的DNA片段 (PCAMBIA3301被限制性核酸內(nèi)切酶XbaI和SacI切成一個大片段和一個小片段，該DNA為 該小片段）替換為序列表序列1所示的DNA分子。在本發(fā)明的一個實施例中，所述重組載 體具體可為：(A)用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI雙酶切植物表達載體pCAMBIA3301得到 載體骨架，用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI雙酶切原核表達載體pBI121，回收約3032bp 的片段，將所述載體骨架和所述片段連接得到重組質(zhì)粒PCBGUS ; (B)用序列表序列1所示的 DNA分子替換重組質(zhì)粒pCB⑶S的XbaI和Sac I識別序列間的片段（重組質(zhì)粒pCB⑶S被限 制性核酸內(nèi)切酶XbaI和SacI切成一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段）得到的重 組載體pCB-IbSSI，pCB-IbSSI表達序列表序列2所示的IbSSI。所述pCB⑶S與pCB-IbSSI 的差別僅在于將pCBGUS的XbaI和SacI識別序列間的DNA片段（pCBGUS被限制性核酸內(nèi) 切酶XbaI和SacI切成一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段）替換為序列表序列 1所示的DNA分子。
[0033] 所述重組微生物可通過將所述重組載體導入出發(fā)微生物得到。
[0034] 所述出發(fā)微生物可為酵母、細菌、藻類或真菌。所述細菌可為革蘭氏陽性細菌或革 蘭氏陰性細菌。所述革蘭氏陰性細菌可為根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)。所 述根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)具體可為根癌農(nóng)桿菌EHA105。
[0035] 所述轉(zhuǎn)基因植物細胞系均不包括繁殖材料。所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所 述IbSSI基因轉(zhuǎn)化受體植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可 以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進入相同物種的其它品種， 特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。
[0036] 所述IbSSI，或，所述編碼所述IbSSI的核酸分子，或，含有所述編碼所述IbSSI的 核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細胞系，在植物淀粉總含量改變和/或 淀粉品質(zhì)改變中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0037] 所述IbSSI，或，所述編碼所述IbSSI的核酸分子，或，含有所述編碼所述IbSSI的 核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細胞系，在培育植物淀粉總含量改變和 /或淀粉品質(zhì)改變的轉(zhuǎn)基因植物中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0038] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0039] 本發(fā)明所提供的一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將編碼所述IbSSI的核酸分子 導入受體植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比淀粉總含 量增加和/或直鏈淀粉含量減少和/或支鏈淀粉含量增加和/或淀粉鏈長分布改變和/或 粘度特性改變。
[0040] 上述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法中，所述編碼所述IbSSI的核酸分子可為如下（1)或 (2)或⑶或（4)所示的DNA分子：
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