因脯氨酸殘基突變而具有降低變應(yīng)原性的真禾本科第5組變應(yīng)原的變體的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】因脯氨酸殘基突變而具有降低變應(yīng)原性的真禾本科第5組 變應(yīng)原的變體
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年12月17日，申請(qǐng)?zhí)枮?01080061431. 9,發(fā)明名稱(chēng)為"因 脯氨酸殘基突變而具有降低變應(yīng)原性的真禾本科第5組變應(yīng)原的變體"的發(fā)明專(zhuān)利的分案 申請(qǐng)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及禾本科（Z3Oaceae)(真禾本科（true grasses))第5組變應(yīng)原重組變 體的制備和使用，其特征在于與已知野生型變應(yīng)原相比，降低IgE反應(yīng)性，并同時(shí)基本保留 與T-淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性。
[0003] 降低IgE反應(yīng)性主要通過(guò)某些脯氨酸殘基的取代或缺失來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述脯氨酸殘基 在第5組變應(yīng)原中高度保守。另外，已認(rèn)識(shí)到第211位氨基酸脯氨酸（Phi p 5. 0109編號(hào)） 是特異性影響變體在水性制劑中的溶解行為的關(guān)鍵位置。
[0004] 這些低變應(yīng)原性的變應(yīng)原變體可用于患有禾草（grass)花粉變態(tài)反應(yīng)的患者的 特異性免疫治療（脫敏作用），或用于防止禾草花粉變態(tài)反應(yīng)發(fā)展的預(yù)防性治療中。
[0005] 本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案涉及來(lái)自梯牧草（Timothy grass) (/5AJeiM?/Traieftse)花粉 的主要變應(yīng)原Phl p 5的變體。
[0006] 發(fā)明背景 1型變態(tài)反應(yīng)具有全球重要性。工業(yè)化國(guó)家中有多達(dá)20%的人口遭受諸如變態(tài)反應(yīng)性 鼻炎、結(jié)膜炎或支氣管哮喘等疾病。
[0007] 這些變態(tài)反應(yīng)由各種起源的來(lái)源引起，例如樹(shù)木和禾草（花粉）、真菌（孢子）、螨 (糞便）、貓或狗。變應(yīng)原來(lái)源可直接釋放到空氣中（花粉、孢子），或可與柴油機(jī)灰粒（花 粉）或室內(nèi)塵埃（螨糞便、皮膚顆粒、毛發(fā)）結(jié)合而到達(dá)空氣中。因?yàn)樽儜B(tài)反應(yīng)-觸發(fā)物質(zhì) 位于空氣中，所以亦使用術(shù)語(yǔ)空氣源性變應(yīng)原（aeroallergen)。
[0008] 1型變態(tài)反應(yīng)-觸發(fā)物質(zhì)為蛋白質(zhì)、糖蛋白或多肽。這些變應(yīng)原經(jīng)由粘膜攝取后， 在致敏人群中與結(jié)合在肥大細(xì)胞表面的IgE分子反應(yīng)。如果這些IgE分子通過(guò)變應(yīng)原相互 交聯(lián)，其結(jié)果是效應(yīng)細(xì)胞分泌介質(zhì)（例如組胺、前列腺素）和細(xì)胞因子，并因此產(chǎn)生相應(yīng)的 變態(tài)反應(yīng)癥狀。
[0009] 多達(dá)40%的1型變態(tài)反應(yīng)患者對(duì)真禾本科花粉提取物表現(xiàn)出特異IgE反應(yīng)性 (Burney 等，1997，J. Allergy Clin. Immunol. 99:314-322 ;D'Amato 等，1998， Allergy 53: 567-578 ；Freidhoff 等,1986, J. Allergy Clin Immunology, 78, 1190-2002)。真禾本科（禾本科）包括10000個(gè)以上的物種，迄今認(rèn)為其中超過(guò)20種為 變態(tài)反應(yīng)癥狀的觸發(fā)物（Andersson 和 Lidholm, 2003，Int. Arch. Allergy Tmmunol. 130:87-107 ；Esch, 2008, Allergy and Allergy Immunotherapy, Clinical Allergy and Immunology Series, 107-126)〇
[0010] 大多數(shù)變態(tài)反應(yīng)-觸發(fā)性真禾本科屬于早熟禾亞科也ae)。除作為野生 形式存在的禾草物種外，例如絨毛草（??/6 1)(絨毛草）、喜濕藹草（/%a Jaris a^/aiica)(金絲雀藹草）、黃花茅（AwiAoxawiA· oobraii/a?)(黃花草）、鴨茅（Zfecijiis ^/oazeraia)(果園草）、牛尾草（/^stoca jOrateasis)(牛尾草）、草地早熟禾（/?? /Traieftsis)(肯塔基藍(lán)草）或多年生黑麥草（ZoJiiM? pereiMe)(黑麥草），栽培谷類(lèi)植物例 如普通小麥aesiiraffi)(小麥）、黑麥（SecaJe cereaJe)(黑麥）和大麥（/ZorofeiM? n/辦are)(大麥）亦是該亞科的已知成員。
[0011] 關(guān)于其變應(yīng)原研究得最為透徹的早熟禾亞科（/5Ooiofeae)物種之一是梯牧草，梯 牧草作為野生植物在世界范圍內(nèi)廣泛分布，作為牧草植物和耐寒性飼用草（hardy feed grass)還有商業(yè)作用。
[0012] 依據(jù)人群中單種變應(yīng)原分子與變態(tài)反應(yīng)患者的IgE抗體反應(yīng)的相對(duì)頻率，對(duì)主要 和次要變應(yīng)原作了區(qū)分。
[0013] 梯牧草中以下六種變應(yīng)原可視為主要變應(yīng)原：Phl p I (Petersen等，1993，J. Allergy Clin. Tmmunol. 92: 789-796)、Phl p 5 (Matthiesen 和 L5wenstein, 1991， Clin. Exp. Allergy 21: 297-307 ;Petersen 等，1992, Int. Arch. Allergy Tmmunol · 98: 105-109)、Phl p 6 (Petersen 等，1995，Int. Arch. Allergy Tmmunol. 108, 49-54)、Phl p 2/3 (Dolecek 等，1993，F(xiàn)EBS 335 (3) : 299-304)、Phl p 4 (Haavik 等，1985，Int. Arch. Allergy Appl. Tmmunol. 78: 260-268 ;Valenta 等，1992， Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294 ；Nandy 等,Biochem. Biophys. Res. Commun·，2005，337(2): 563-70)和 Phl p 13 (Suck 等，2000，Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402)。
[0014] 梯牧草中占優(yōu)勢(shì)的主要變應(yīng)原為Phl p I和Phl p 5 (Andersson和Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Tmmunol. 130:87-107)，其中 Phl p 5 以兩種形式存在，即 5a和5b，其由獨(dú)立的基因編碼，在分子量上有差別。按照變應(yīng)原的正式命名法，將Phl p 5a稱(chēng)為Phl p 5. 01而將Phl p 5b稱(chēng)為Phl p 5.02 (WH0/IUIS變應(yīng)原命名小組委員會(huì)， WWW. allergen, org)。Phl p 5a和Phl p 5b二者的氨基酸序列都來(lái)源于克隆的cDNA序 列。已鑒定兩種同工型的天然變體，兩者通過(guò)點(diǎn)突變區(qū)別于彼此，對(duì)應(yīng)于不同的等位基因 形式（Vrtala 等，1993，J. Immunol·, 151: 4773-4781 ;Gelhar 等，1997，Eur. J. Biochem·, 247: 217-23)。這些變體在 WH0/IUIS 數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄為 Phl p 5. Olxx 和 Phl p 5· 02xx〇
[0015] 天然Phl p 5a (nPhl p 5a)為約32 kDa的蛋白質(zhì)，與85-90%的禾草花粉變態(tài)反 應(yīng)患者的 IgE 抗體反應(yīng)（Rossi 等，2000，Allergy Int.，49: 93-97)〇
[0016] 來(lái)自禾本科特別是早熟禾亞科的親緣真禾本科物種（例如多年生黑麥草和草地 早熟禾）的花粉，含有與Phl p 5同源的變應(yīng)原，將其和Phl p 5-起稱(chēng)作第5組變應(yīng)原。這 些第5組變應(yīng)原的高度結(jié)構(gòu)同源性相應(yīng)地導(dǎo)致分子與IgE抗體的高度交叉反應(yīng)性（Lorenz 等，2009，Int. Arch. Immunol. 148:1-17)。最終，這種交叉反應(yīng)性意味著一種禾草物種 的敏化可足可以觸發(fā)其它親緣禾草的變態(tài)反應(yīng)。
[0017] 第5組變應(yīng)原的高度交叉反應(yīng)性根本上是基于同源變應(yīng)原的相似一級(jí)序列。這通 過(guò)所選早熟禾亞科物種的第5組變應(yīng)原的氨基酸序列比較來(lái)顯示（圖1)。
[0018] 除第5組變應(yīng)原彼此間的交叉反應(yīng)性外，亦已知Phl p 5與梯牧草另一主要變 應(yīng)原的交叉反應(yīng)性（L0wenstein，1978，Allergy 33: 30-41 ;Petersen 等，1995，Int. Arch. Allergy Tmmunol. 108: 55-59 ; Blume 等，2004，Proteomics 4: 1366-71)。變 應(yīng)原Phl p 6的多肽鏈表現(xiàn)出與多種Phl p 5序列N-末端半部分（N-terminal half)有 很大的相似性（圖1)。認(rèn)為變應(yīng)原可追溯到共同的起源基因。兩組變應(yīng)原間的相似性具 有以下作用：一些Phl p 5-反應(yīng)性的IgE抗體亦可結(jié)合Phl p 6 (Petersen等，1995， Int. Arch. Allergy Tmmunol · 108: 49-54 ;Andersson 和 Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Tmmunol. 130:87-107)。
[0019] 過(guò)去，業(yè)已通過(guò)NMR光譜學(xué)或X-射線結(jié)構(gòu)分析闡明了很多變應(yīng)原的3D結(jié)構(gòu)，尤 其是將3D結(jié)構(gòu)作為IgE-結(jié)合表位在蛋白質(zhì)表面上定位的基礎(chǔ)。就禾草花粉的第5組變 應(yīng)原而言，迄今不可能產(chǎn)生包括整個(gè)多肽鏈的模型（Rajashankar等，2002，ActaCryst. D58:1175-1181 ;Maglio 等，2002，Protein Engineering 15: 635-642)。
[0020] 基于變應(yīng)原Phl p 6 (RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)條目：1NLX)和Phl p 5b半分子（RCSB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)條目：1N3P)的3D結(jié)構(gòu)，有可能產(chǎn)生Phl p 5a的同源模型（Wald等，2007， Clin. Exp. Allergy 37:441-450)。根據(jù)這個(gè)模型，由兩個(gè)螺旋束構(gòu)成Phl p 5a，但該同源 模型無(wú)法解釋兩束彼此之間的精確位置（圖2)。
[0021] 將特異性免疫治療（SIT)或脫敏作用視作治療性治療變態(tài)反應(yīng)的有效方法 (Fiebig 1995 Allergo J. 4 (6):336-339, Bousquet 等，1998， J. Allergy Clin. Immunol. 102 (4): 558-562) ;Cox等，2007， J. Allergy Clin. Tmmunol. 120:S25-85 ； James和 Durham, 2008， Clin. Exp. Allergy 38: 1074-1088)。
[0022] 業(yè)已成功使用注射療法的經(jīng)典治療形式（SCIT)達(dá)約100年，在所述SCIT中，以逐 漸增加的劑量將天然變應(yīng)原提取物皮下注射給患者。在該療法中，變態(tài)反應(yīng)患者的免疫系 統(tǒng)反復(fù)遭遇變應(yīng)原，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)重編程序以同時(shí)獲得對(duì)變應(yīng)原的耐受性。在通過(guò)抗原呈 遞細(xì)胞自變應(yīng)原制劑攝取抗原后，將肽呈遞給細(xì)胞表面上的抗原。抗原特異性T-細(xì)胞識(shí)別 一些含有所謂的T-細(xì)胞表位的特定肽。這種結(jié)合尤其導(dǎo)致具調(diào)控功能的各種類(lèi)型T-細(xì)胞 的發(fā)育。在SIT療程中，調(diào)控T-細(xì)胞的應(yīng)答導(dǎo)致：對(duì)變應(yīng)原的耐受性；T H2細(xì)胞因子的下調(diào)； TH1/TH2平衡的恢復(fù)；變應(yīng)原-特異性IgE的抑制；IgG4、IgGl和IgA抗體的誘導(dǎo)；效應(yīng)細(xì) 胞（肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞）的抑制和炎癥組織的更新（Akdis等，2007， J. Allergy Clin. Tmmunol. 119 (4) :780-789 ; Larchfe 等，2008，Nature Reviews 6:761-771)。因此，在脫敏作用情況下，T-細(xì)胞表位對(duì)變應(yīng)原制劑的治療作用至關(guān)重要。
[0023] 由于在IgE以及T-細(xì)胞水平中存在的真禾本科主要變應(yīng)原的交叉反應(yīng)性，用 單個(gè)代表性的禾草物種的變應(yīng)原提取物通常足以成功治療（Mailing等，1993，EAACI Position Paper: Immunotherapy, Allergy 48: 9 35 ；Cox 等，2007, J Allergy Clin Tmmunol 120: 25-85)。
[0024] 除皮下免疫治療外，經(jīng)由口腔粘膜攝入變應(yīng)原或變應(yīng)原衍生物的舌下治療形式正 在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，用作注射療法的備選（James和Durham, 2008，Clin. Exp. Allergy 38: 1074-1088)。
[0025] 更多的可能性是用編碼相關(guān)變應(yīng)原的可表達(dá)的DNA (免疫治療性接種）來(lái)治療。 在嚙齒動(dòng)物中通過(guò)注射編碼變應(yīng)原的DNA為變應(yīng)原-特異性影響免疫應(yīng)答提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù) (Hsu 等 1996，Nature Medicine 2 (5):540-544 ;Weiss等，2006，Int. Arch. Allergy Tmmunol. 139: 332-345)。
[0026] 在所有這些治療形式中，都有變態(tài)反應(yīng)或過(guò)敏性休克的根本風(fēng)險(xiǎn)（Kleine-Tebbe， 2006，Allergologie，4:135-156)。為使這些風(fēng)險(xiǎn)最小化，采用類(lèi)變應(yīng)原形式的創(chuàng)新制劑。 這些制劑為化學(xué)修飾的變應(yīng)原提取物，其顯著降低IgE反應(yīng)性，而與未處理的提取物有相 同的 T-細(xì)胞反應(yīng)性（Fiebig 1995 AllergoJ. 4 (6) :336-339 ;Kahlert 等，1999，Int. Arch. Allergy Immunol, 120: 146-157)。
[0027] 可能用通過(guò)重組方法制備的變應(yīng)原來(lái)進(jìn)行療法優(yōu)化。通過(guò)重組方法制備的高純度 變應(yīng)原的確定混合物（cocktail)(任選與患者獨(dú)特敏化模式匹配），可取代來(lái)自天然變應(yīng) 原來(lái)源的提取物，因?yàn)槌烁鞣N變應(yīng)原外，后者還含有相對(duì)大量的免疫原性的，但非變應(yīng)原 性的伴隨蛋白。業(yè)已成功實(shí)施重組變應(yīng)原的初期臨床研究（Jutel等，2005，J. Allergy Clin. Immunol·, 116: 608-613 ;Valenta 和 Niederberger， 2007， J. Allergy Clin. Immunol. 119: 826-830)。
[0028] 通過(guò)突變的重組變應(yīng)原特別提供了可用重組表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生安全的脫敏作用的現(xiàn) 實(shí)前景，在所述突變的重組變應(yīng)原中，修飾了 IgE表位，而未損傷治療所必需的T-細(xì)胞表位 (Schramm等1999，J. Immunol. 162:2406-2414)。可在SIT期間以相對(duì)高劑量使用這些 低變應(yīng)原性蛋白，而不增加所不希望的IgE引發(fā)的副作用的可能性。
[0029] 過(guò)去，針對(duì)很多空氣源性變應(yīng)原（尤其是花粉和室內(nèi)塵螨變應(yīng)原）和食物變應(yīng)原， 業(yè)已發(fā)表了具降低IgE結(jié)合性的此類(lèi)"低變應(yīng)原性"變體。基于未修飾的變應(yīng)原的DNA，已有 可能制備和表達(dá)重組DNA，尤其是通過(guò)變應(yīng)原個(gè)別部分的片段化、寡聚化、缺失、點(diǎn)突變或重 組（DNA 改組）來(lái)制備和表達(dá)重組 DNA (Ferreira 等，2006，Inflamm. & Allergy- Drug Targets 5: 5 14 ;Bhalla和 Singh, 2008，Trends in Biotechnology 26:153-161)。
[0030] 關(guān)于禾草花粉變應(yīng)原，闡述了第l、2、5a、5b、6、7和12組的低變應(yīng)原性變體 (hypoallergenic variant) (Ferreira等，2006, Inflamm. & Allergy - Drug Targets 5: 5 14;Westritschnig 等，2007，J. Tmmunol. 179: 7624-7634)〇
[0031] 迄今為止，許多出版物闡述了開(kāi)發(fā)低變應(yīng)原性第5組變應(yīng)原的方法。對(duì)于Phl p 5a和Phl p 5b，已表明兩個(gè)序列部分的合并缺失導(dǎo)致IgE結(jié)合性的大幅降低和刺激嗜堿性 效應(yīng)細(xì)胞的能力降低。然而，與未修飾的變應(yīng)原相比，缺失突變體的T-細(xì)胞反應(yīng)性僅有輕 微改變（Schramm 等，1999，J. Immunol. 162: 2406-2414 ;Wald 等，2007，Clin·Exp· Allergy 37:441-450)〇
[0032] 在另一篇文章中，通過(guò)氨基酸取代和/或C末端的短的缺失來(lái)修飾來(lái)自黑麥草的 第 5 組變應(yīng)原（Lol p 5) (Swoboda 等，2002，Eur. J. Immunol. 32: 270-280)。突變 不限于特定的氨基酸類(lèi)型。被取代的氨基酸為賴氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸或丙氨酸。 同樣也闡述了通過(guò)很多個(gè)別氨基酸殘基的特異性突變來(lái)產(chǎn)生低變應(yīng)原性突變體的概念性 方法。Gelhar等描述了通過(guò)用丙氨酸取代位于蛋白質(zhì)表面的賴氨酸殘基來(lái)產(chǎn)生重組Phl p 5b 片段（Gelhar 等，2006，Int. Arch. Allergy Tmmunol. 140:285-294)。然而，對(duì)于禾 草花粉的第5組變應(yīng)原，迄今仍未發(fā)表基于脯氨酸殘基點(diǎn)突變的突變策略。
[0033] 本發(fā)明所基于的目的在于在蛋白質(zhì)和DNA水平上提供禾本科第5組變應(yīng)原的新型 重組變體，其區(qū)別在于降低IgE反應(yīng)性而同時(shí)基本保留T-細(xì)胞的反應(yīng)性，因此適于治療性 和預(yù)防性的特異性免疫治療和免疫治療性的DNA接種。
[0034] 發(fā)明描述 意想不到地發(fā)現(xiàn)，與野生型變應(yīng)原相比，真禾本科（禾本科）第5組變應(yīng)原的變體降低 了 IgE反應(yīng)性，同時(shí)基本保留了與T-淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性，并因此是低變應(yīng)原性的，在所述變 體中，將在比對(duì)中對(duì)應(yīng)于野生型Phl p 5. 0109氨基酸序列的第57、58、117、146、155、211、 229位脯氨酸的脯氨酸單獨(dú)或組合突變。
[0035] 因此，本發(fā)明涉及真禾本科（禾本科）第5組變應(yīng)原的低變應(yīng)原性變體，其中將在 比對(duì)中對(duì)應(yīng)于野生型Phl p 5. 0109氨基酸序列的第57、58、117、146、155、211、229位脯氨 酸的脯氨酸單獨(dú)或組合突變。
[0036] 特別優(yōu)選本發(fā)明的變應(yīng)原變體，其特征為脯氨酸已缺失或被取代。
[0037] 優(yōu)選來(lái)自早熟禾亞科的第5組變應(yīng)原的本發(fā)明低變應(yīng)原性變體，優(yōu)選來(lái)自早熟禾 超族（Z5OOiZae)和小麥族（7>iiic〇i/ae)，優(yōu)選由以下物種來(lái)代表：梯牧草、絨毛草、喜濕藹 草、黃花茅、鴨茅、多年生黑麥草、草地早熟禾、牛尾草、大麥、黑麥和普通小麥。它們是來(lái)自 普通小麥、黑麥和大麥的Tri a 5、Sec c 5和Hor V 5的本發(fā)明優(yōu)選的低變應(yīng)原性變體。特 別優(yōu)選來(lái)自早熟禾超族第5組變應(yīng)原的本發(fā)明低變應(yīng)原性變體。這些第5組變應(yīng)原優(yōu)選來(lái) 自草地早熟禾、鴨茅、絨毛草、多年生黑麥草和喜濕藹草的Poa p 5、Dac g 5、Hol p 5、Lol p 5和Pha a 5,尤其特別優(yōu)選來(lái)自梯牧草的Phl p 5。上述變應(yīng)原的所有天然存在的異構(gòu) 體、多形體（polymorph)和變體及其前體蛋白亦符合本發(fā)明。
[0038] 在本發(fā)明低變應(yīng)原性變體中，突變的脯氨酸優(yōu)選為在比對(duì)（圖la)中對(duì)應(yīng)于以 下位置脯氨酸的那些：成熟Phl p 5. 0109 (Phi p 5 a，UniProtKB條目：Q84UI2)(圖3 和 4, SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2)或其變體（圖 Ib)或成熟 Phl p 5.0201 (Phi p5 b ; Swiss-Prot :Q40963. 2 ;圖 24，SEQ ID NO: 5)或其變體（圖 lb)的氨基酸序列的第 57、58、 117、146、155、211或229位脯氨酸，特別優(yōu)選成熟Phl p 5. 0109的氨基酸序列的第57、58、 117、146、155、211 或 229 位脯氨酸。
[0039] 盡管已知脯氨酸可對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，但是以脯氨酸殘基的特異性 點(diǎn)突變作為起始點(diǎn)來(lái)產(chǎn)生變應(yīng)原的低變應(yīng)原性突變體，僅僅