為5. 0，其中Na2HPO4的摩爾濃度為0. 2M、檸檬酸的摩爾濃度為 0. 1M，配制方法示例：取I. 42gNa2HP04、0. 96g檸檬酸，然后加入CldH2O至50mL，即得；
[0054] 洗脫液的配制方法示例：將木瓜蛋白酶用pH 8. 0, 0. lmol/L Tris-HCI緩沖液配 制成l-2mg/mL，再加入lmmol/L二硫蘇糖醇（DTT)37°C孵育30min，得洗脫液；
[0055] 上樣緩沖液可由如下比例的組分配制而成=Tris-HCl :1%溴酚藍(lán)：ddH20 :甘氨酸 =15. 5 :2· 5 :7 :25,其中 Tris-HCl 的 pH 為 6. 8、摩爾濃度為 IM ;
[0056] 電泳緩沖液的配制方法如下：取3. Og Tris、14. 4g甘氨酸、溶于800mLddH20中，調(diào) pH至8. 3后，定容至IL ;
[0057] 可捕獲金屬鉛離子的物質(zhì)（抗鉛離子抗體）為與鉛特異性結(jié)合的物質(zhì)為鼠抗Pb mAb，購買自巴傲得生物科技有限公司，貨號為巴傲得AP7019。
[0058] 與低密度脂蛋白特異結(jié)合的物質(zhì)、捕獲低密度脂蛋白的物質(zhì)、抗低密度脂蛋白抗 體可以是同一種物質(zhì)，可通過購買得到，在本發(fā)明中選用為英國Abcam公司生產(chǎn)的"型號為 Abeam abl57795 "的 Anti-LDL 抗體。
[0059] 本發(fā)明提供了一種鉛-低密度脂蛋白螯合物，其是由鉛離子通過鋅指結(jié)構(gòu)、巰基、 半胱氨酸殘基中的至少一種結(jié)構(gòu)與低密度脂蛋白螯合形成。
[0060] 鉛-低密度脂蛋白螯合物是由鉛離子通過鋅指結(jié)構(gòu)、巰基、半胱氨酸殘基中的至 少一種結(jié)構(gòu)與低密度脂蛋白上的載脂蛋白B或膽固醇、甘油三酯等螯合形成。
[0061] 本發(fā)明還提供了如上所述的鉛-低密度脂蛋白螯合物的一種制備方法，其包括以 下步驟：
[0062] 1)鉛-低密度脂蛋白螯合物的合成步驟：
[0063] 鉛離子向人源的低密度脂蛋白中加入鉛離子進(jìn)行螯合反應(yīng)；
[0064] 2)鉛-低密度脂蛋白螯合物的純化步驟：
[0065] 采用免疫親和層析去除步驟1)獲得的鉛-低密度脂蛋白螯合物中未參與反應(yīng)的 低密度脂蛋白及鉛離子。
[0066] 所述步驟1)中包括以下步驟：
[0067] 在提純源于人體的低密度脂蛋白或/和生物學(xué)方法重組的低密度脂蛋白中加入 鉛離子進(jìn)行螯合反應(yīng)；
[0068] 所述步驟2)中包括以下步驟：
[0069] A.將步驟1)制得的鉛-低密度脂蛋白螯合物復(fù)溶于生理鹽水中，得到復(fù)溶液；
[0070] B.平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱，將含有能夠與低密度脂蛋白特異性 結(jié)合的物質(zhì)的填料裝柱后，然后用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0071] C.上樣：上樣前，用稀釋緩沖液稀釋復(fù)溶液，然后上樣，鉛-低密度脂蛋白螯合物、 未與鉛離子反應(yīng)的低密度脂蛋白均吸附在填料上，未反應(yīng)的鉛離子隨緩沖液流出；
[0072] D.洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.1 M的Na2HPO4 溶液進(jìn)行洗脫；；
[0073] E.收集洗脫液；收集完畢后立即用使蛋白復(fù)性；
[0074] F.透析：將收集到的洗脫液裝入透析袋用CldH2O透析除鹽，換水2~4次后，4°C透 析過夜，收集透析袋內(nèi)的樣本；
[0075] G.平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗新的層析柱，將能夠與Pb特異性結(jié)合的填料 裝柱后，然后用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0076] H.上樣：上樣前，用稀釋緩沖液稀釋樣本，然后上樣；鉛-低密度脂蛋白螯合物吸 附在填料上，未反應(yīng)的低密度脂蛋白會隨稀釋緩沖液流出；
[0077] I.洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. OM的Na2HPO4 溶液進(jìn)行洗脫；此時鉛-低密度脂蛋白螯合物隨著洗脫液洗脫出來，
[0078] J.收集洗脫液；收集完畢后立即用使蛋白復(fù)性；
[0079] K.將收集到的洗脫液裝入透析袋用CldH2O透析除鹽，換水三次后，4°C透析過夜，收 集透析袋內(nèi)的樣本，得到純化的鉛-低密度脂蛋白螯合物。
[0080] 上述制備方法還包括3)對鉛-低密度脂蛋白螯合物的鑒定步驟：
[0081] I .制備膠床：選擇瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、SDS-聚丙烯酰胺凝膠中的一種 作為介質(zhì)，制備膠床；
[0082] II .加樣：取步驟2)所制得的鉛-低密度脂蛋白螯合物，加入上樣緩沖液并混合 均勻，然后加樣于樣品槽中；
[0083] III .電泳：連接電泳板進(jìn)行電泳；
[0084] IV .復(fù)溶檢測：在膠床上找出含鉛的蛋白條帶，將該條帶取出并溶解，然后利用 ICP-MS法或AAS法檢測該液體中是否含有鉛以及鉛含量。
[0085] 本發(fā)明還提供了一種至少包括以如上所述的鉛-低密度脂蛋白螯合物作為對照 品的試劑盒。該試劑盒用于檢測鉛-低密度脂蛋白螯合物，以提高檢測的準(zhǔn)確性，重復(fù)性， 并使之在臨床中得到推廣。
[0086] 優(yōu)選地，該試劑盒還包括包被液，該包被液為捕獲LDL的物質(zhì)或捕獲鉛的物質(zhì)。
[0087] 在本發(fā)明中，能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的試劑盒可以列出以下幾種，但并不限于此。
[0088] -種用于檢測鉛-低密度脂蛋白螯合物的試劑盒，包括：含有可捕獲低密度脂蛋 白的物質(zhì)的包被液、封閉液、洗滌液、作為二抗的可以捕獲金屬Pb的物質(zhì)、酶標(biāo)抗體、底物、 終止液、樣品緩沖液、陽性對照、陰性對照等。
[0089] -種用于檢測鉛-低密度脂蛋白螯合物的試劑盒，包括：含有可捕獲低密度脂蛋 白的物質(zhì)的包被液、封閉液、洗滌液、洗脫液等。
[0090] -種用于檢測鉛-低密度脂蛋白螯合物的試劑盒，包括：含有可捕獲低密度脂蛋 白的物質(zhì)的包被液、封閉液、洗滌液、洗脫液、硝酸、過氧化氫等。
[0091] -種用于檢測鉛-低密度脂蛋白螯合物的試劑盒，包括：用于提純血液低密度脂 蛋白所需溶液、復(fù)溶液、含有可捕獲鉛的物質(zhì)的包被液、封閉液、洗滌液、酶標(biāo)抗體、底物、終 止液、樣品緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照等。
[0092] -種用于檢測鉛-低密度脂蛋白螯合物的試劑盒，包括：用于提純血液低密度脂 蛋白所需溶液、復(fù)溶液等。
[0093] -種用于檢測鉛-低密度脂蛋白螯合物的試劑盒，包括：用于提純血液低密度脂 蛋白所需溶液、復(fù)溶液、硝酸、過氧化氫等。
[0094] -種用于檢測鉛-低密度脂蛋白螯合物的試劑盒，包括：用于提純血液低密度脂 蛋白所需溶液、膠床介質(zhì)、復(fù)溶液、加樣緩沖液、溶解膠床上含鉛的蛋白條帶所需液體、含有 可捕獲鉛的物質(zhì)的包被液、封閉液、洗滌液、酶標(biāo)抗體、底物、終止液、樣品緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品、 陰性對照等。
[0095] -種用于檢測鉛-低密度脂蛋白螯合物的試劑盒，包括：用于提純血液低密度脂 蛋白所需溶液、膠床介質(zhì)、復(fù)溶液、加樣緩沖液、溶解膠床上含鉛的蛋白條帶所需液體等。
[0096] -種用于檢測鉛-低密度脂蛋白螯合物的試劑盒，包括用于提純血液低密度脂蛋 白所需溶液、膠床介質(zhì)、復(fù)溶液、加樣緩沖液、溶解膠床上含鉛的蛋白條帶所需液體、酸化劑 (如硝酸）、過氧化氫等。
[0097] 上述試劑盒中，用于提純血液低密度脂蛋白所需溶液為PEG溶液、硼酸鹽緩沖 液等（采用PEG法），捕獲低密度脂蛋白的物質(zhì)可以通過購買得到，在本發(fā)明中選用為 "Genetex gtxl6419" ;所述酶標(biāo)抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體 中的一種，所述述用于提純血液低密度脂蛋白所需溶液為PEG溶液、硼酸鹽緩沖液中的一 種；所述膠床介質(zhì)為瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、SDS-聚丙烯酰胺凝膠中的一種，所述酶 標(biāo)抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種，所述陽性對照或標(biāo) 準(zhǔn)品為鉛-低密度脂蛋白螯合物。
[0098] 本發(fā)明還提供了一種定量檢測鉛-低密度脂蛋白螯合物的方法，以已知含量的 上述的鉛-低密度脂蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用以下方法之一對樣品進(jìn)行檢測：酶聯(lián)免 疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純 鉛-低密度脂蛋白螯合物與酶聯(lián)免疫法、提純鉛-低密度脂蛋白螯合物與原子吸收光譜結(jié) 合法、提純鉛-低密度脂蛋白螯合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或 原子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。在本發(fā)明中，用檢測鉛鉛螯合型免疫復(fù)合 物的方法可以列出的有以下幾種，但并不限于以下幾種。
[0099] 方法一:酶聯(lián)免疫法檢測鉛-低密度脂蛋白螯合物，按以下步驟進(jìn)行檢測：
[0100] 1)將前面所述的可以捕獲低密度脂蛋白的蛋白，如抗LDL抗體蛋白包被于固相載 體上：用稀釋緩沖液稀釋包被蛋白至250~2000倍，加入ELISA板微孔中，4°C下過夜16-18 小時，或37°C水浴1-3小時，儲存冰箱；
[0101] 2)封閉：移去包被液，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入1 % -5%牛血清 白蛋白或脫脂奶粉作為封閉液，37°C放置1小時，移去封閉液，并用相應(yīng)洗滌液進(jìn)行洗滌。 洗滌完成后，ELISA板于37°C放置1小時；
[0102] 3)加待檢樣品，并且溫育：從循環(huán)系統(tǒng)中取樣，作待檢樣品；以已知含量的鉛-低 密度脂蛋白螯合物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液稀釋樣品至10~40倍，加入微孔中，37°C作用 1-2小時；
[0103] 4)加入抗Pb抗體，并且溫育：移去待檢樣品，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成 后，加入用稀釋緩沖液稀釋的抗Pb抗體50000~400000倍，37°C作用1-2小時，使其與低 密度脂蛋白上的金屬鉛反應(yīng)；
[0104] 5)酶結(jié)合物溫育：移去抗Pb抗體，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入用稀 釋緩沖液稀釋的酶標(biāo)抗體（如HRP酶標(biāo)抗體），37°C作用1-2小時，使其與抗pb抗體反應(yīng)；
[0105] 6)底物溫育：移去酶標(biāo)抗體，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入底物， 37°C下避光作用30min ;
[0106] 7)終止反應(yīng)：滴加終止液至每一微孔；
[0107] 8)加完終止液后，取450nm波長，并