一種優(yōu)化有機(jī)磷水解酶酵母工程菌及其酶的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種有機(jī)磷水解酶的重組酵母表達(dá)菌株的構(gòu)建方法及該工程菌高密 度的發(fā)酵方法，屬于基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】：
[0002] 有機(jī)磷農(nóng)藥因具有高效、低成本、殺蟲(chóng)廣泛等特點(diǎn)，對(duì)農(nóng)業(yè)發(fā)展和人類(lèi)糧食供給做 出了巨大的貢獻(xiàn)。目前我國(guó)生產(chǎn)的農(nóng)藥中，有機(jī)磷農(nóng)藥占到了農(nóng)藥總量的70%以上，有機(jī)磷 農(nóng)藥的大量不合理使用也使得蔬菜、糧食、瓜果等農(nóng)產(chǎn)品以及土壤、水體中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘 留嚴(yán)重超標(biāo)。但由于有機(jī)磷農(nóng)藥具有較強(qiáng)的毒性，能抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶的 活性，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)乙酰膽堿的大量聚集而中毒，和不易被降解等特點(diǎn)，農(nóng)村大量使用有機(jī) 磷農(nóng)藥的同時(shí)又帶來(lái)了日益嚴(yán)重的環(huán)境污染與人畜健康問(wèn)題，甚至對(duì)農(nóng)產(chǎn)品出口創(chuàng)匯也造 成了嚴(yán)重影響。
[0003] 有機(jī)磷水解酶又稱(chēng)磷酸三酯酶，廣泛存在于自然界中的生物體內(nèi)，它可以降解包 括有機(jī)磷神經(jīng)毒化學(xué)戰(zhàn)劑和一些廣泛使用的農(nóng)用殺蟲(chóng)劑在內(nèi)的一大類(lèi)有機(jī)磷化合物，其作 用原理通常為：將有機(jī)磷農(nóng)藥分子中的磷酯鍵斷裂，使有機(jī)磷農(nóng)藥分解為環(huán)境可以接受的 低毒或無(wú)毒小分子物質(zhì)，從而達(dá)到降低毒性的目的。自1973年Sethunarhan等從土壤中分 離出乙基對(duì)硫磷降解Flavobacterium sp. ATCC 27551以來(lái)，農(nóng)藥降解菌研究的序幕被正式 拉開(kāi)，農(nóng)藥降解菌的篩選及相關(guān)基因的研究也成為了國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的主要研究方向。目前 為止，人們已經(jīng)篩選出的有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌近百種，其中包括細(xì)菌、真菌、放線菌以及藻類(lèi) 等。然而，隨著環(huán)境中有機(jī)磷農(nóng)藥釋放量的日益增加，天然存在于自然界的這些有機(jī)磷農(nóng)藥 降解菌顯然已經(jīng)不能滿足人類(lèi)的降毒要求。所以研究者們利用微生物高效表達(dá)系統(tǒng)（如： 大腸桿菌、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)）大量表達(dá)了有機(jī)磷水解酶，表達(dá)量相對(duì)原始菌株明顯提高。 但在原核表達(dá)系統(tǒng)中，因既不能對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工，也不能對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行 糖基化修飾，所以經(jīng)常導(dǎo)致表達(dá)的蛋白沒(méi)有活性；另外，蛋白質(zhì)的表達(dá)量不高，且胞內(nèi)表達(dá) 雜蛋白較多，不易純化，達(dá)不到廉價(jià)大規(guī)模生產(chǎn)的目的，所以實(shí)用性有限。酵母具有微生物 和真核生物的雙重特點(diǎn)，它可以對(duì)體內(nèi)表達(dá)的異源蛋白進(jìn)行修飾，當(dāng)采用酵母信號(hào)肽時(shí)，蛋 白能被正確折疊和加工，然后分泌到培養(yǎng)基中。相對(duì)原核表達(dá)系統(tǒng)而言，真核酵母表達(dá)系統(tǒng) 表達(dá)的酶表達(dá)量高且容易純化，目前已經(jīng)有多種蛋白利用酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了大規(guī)模工業(yè) 化生產(chǎn)。其中畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前工業(yè)化生產(chǎn)蛋白酶常見(jiàn)的表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母表達(dá) 系統(tǒng)主要有以下特點(diǎn)：①具有強(qiáng)有力的乙醇氧化酶（Alochol Oxidase，A0X1)基因啟動(dòng)子， 可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)；②作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工與 修飾，從而使表達(dá)出的蛋白具有生物活性；③營(yíng)養(yǎng)要求低、生長(zhǎng)快、培養(yǎng)基廉價(jià)，便于工業(yè)化 生產(chǎn)；④可高密度發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中細(xì)胞干重甚至可達(dá)120g/L以上；⑤表達(dá)量高，許多 蛋白可達(dá)到克級(jí)每升以上水平。初曉宇等將假單胞菌來(lái)源的有機(jī)磷水解酶基因0phc2克隆 并整合到畢赤酵母基因組中，成功實(shí)現(xiàn)該酶的異源表達(dá)，3L高密度發(fā)酵表達(dá)量達(dá)到5. 5g/ L0
[0004] 隨著分子生物學(xué)研究的飛速發(fā)展，各種基因工程操作技術(shù)的迅速出現(xiàn)，如今合成 生物學(xué)已經(jīng)發(fā)展成為一門(mén)熱門(mén)學(xué)科，并且被應(yīng)用到科研和工業(yè)生產(chǎn)中。Biobricks技術(shù)是近 年發(fā)展出來(lái)的一種廣泛應(yīng)用于合成生物學(xué)中的重組DNA的方法，其實(shí)質(zhì)是通過(guò)基因片段的 巧妙拼接實(shí)現(xiàn)DNA片段重組。本發(fā)明中即采用Biobricks技術(shù)，將有機(jī)磷水解酶基因巧妙 拼接，獲得有機(jī)磷水解酶基因多拷貝畢赤酵母表達(dá)載體，并成功整合至酵母基因組，獲得表 達(dá)量達(dá)到8. lg/L的有機(jī)磷水解酶重組菌株，為工業(yè)化大規(guī)模廉價(jià)生產(chǎn)有機(jī)磷水解酶奠定 了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是首先根據(jù)酵母密碼子偏愛(ài)性，人工優(yōu)化合成有機(jī)磷水解酶基因 (OphcM)，然后構(gòu)建并篩選多拷貝有機(jī)磷水解酶基因畢赤酵母高效表達(dá)菌株，最后通過(guò)高密 度發(fā)酵的方法提高單位體積的有機(jī)磷水解酶產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，為該酶的大規(guī)模工業(yè)化 生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明的步驟為：
[0007] 1、優(yōu)化合成有機(jī)磷水解酶基因（OphcM)
[0008] 將來(lái)源于Pseudomonas pseudoalcaligenes 的有機(jī)憐水解酶基因 0phc2 (Genebank ID :AJ605330. 1，其中，基因長(zhǎng)度為906bp，編碼301個(gè)氨基酸）進(jìn)行改造，在不改變?cè)被?酸編碼序列的原則下，按照酵母密碼子偏愛(ài)性對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，采用套疊 PCR的方法進(jìn)行基 因合成，優(yōu)化改造的基因序列見(jiàn)圖1，命名為OphcM。優(yōu)化后的核酸序列與原始核酸序列相 比，253個(gè)核酸發(fā)生改變，改造前后核苷酸序列相比，同源性為72. 08%，同時(shí)為了使有機(jī)磷 水解酶在畢赤酵母中高效穩(wěn)定地分泌表達(dá)，優(yōu)化后的有機(jī)磷水解酶基因去掉了編碼5'端信 號(hào)肽序列的22氨基酸（詳見(jiàn)圖2的第2至23)。
[0009] 2、多拷貝有機(jī)磷水解酶畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程
[0010] 將有機(jī)磷水解酶基因 OphcM兩端引入酶切位點(diǎn)Cop I和Not I，并克隆到畢 赤酵母高效表達(dá)載體PHBM905BDM(專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)CN103555749A)中，獲得單拷貝表達(dá)載 體BDM-OphcM-IC ;然后采用傳統(tǒng)的基因工程操作技術(shù)，分別通過(guò)限制酶EcoR I、Xba I、Spe I和BamH I的酶切，先后獲得多拷貝表達(dá)載體BDM-〇phcM-2C、BDM-〇phcM-3C、 BDM-0phcM-4C。載體構(gòu)建具體過(guò)程如圖4。
[0011] 3、構(gòu)建多拷貝有機(jī)磷水解酶基因畢赤酵母表達(dá)重組菌株
[0012] 將上述多拷貝表達(dá)載體BDM-〇phcM-2C、BDM-〇phcM-3C、BDM-0phcM-4C采用化學(xué)轉(zhuǎn) 化法，分別轉(zhuǎn)化到Pichia pastoris GS115Mut+中，通過(guò)在MD平板上生長(zhǎng)，并采用菌落PCR 的方法進(jìn)行驗(yàn)證，然后搖瓶發(fā)酵，具體方法為：將轉(zhuǎn)化后重組菌株接種到BMGY培養(yǎng)基中在 28°C培養(yǎng)48h后，離心去上清將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到BMMY培養(yǎng)基中，每24h取樣并用1 %的甲醇進(jìn) 行誘導(dǎo)。樣品離心去除沉淀，用上清跑SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況，并用上清與 底物甲基對(duì)硫磷反應(yīng)，檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物是否有活性。通過(guò)以上篩選方法分別獲得單拷貝、二 拷貝、三拷貝、四拷貝的重組菌株，分別命名為Pichia pastoris OphcMUPichia pastoris 0phcM2、Pichia pastoris 0phcM3、Pichia pastoris 0phcM4〇
[0013] 4、將篩選到的多種重組菌株，分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，在相同的培養(yǎng)條件下，保證菌體 量基本一致的前提下，通過(guò)多次搖瓶試驗(yàn)，比較1-4拷貝的重組酵母表達(dá)量和酶活，其中， Pichia pastoris OphcM2菌株的表達(dá)量和活性最高，如圖6所示。
[0014] 5、將重組酵母高密度發(fā)酵，制備生產(chǎn)有機(jī)磷水解酶；其中包括種子培養(yǎng)、菌體生長(zhǎng) 階段、碳源飼喂階段和甲醇誘導(dǎo)表達(dá)階段等四個(gè)常規(guī)發(fā)酵生產(chǎn)酶的步驟。
[0015] 使用本發(fā)明將重組酵母Pichia pastoris 0phcM2菌株在5升發(fā)酵罐發(fā)酵144小 時(shí)表達(dá)量達(dá)8. 1克/升，在發(fā)酵96小時(shí)，酶比活達(dá)到12. 85U/mL，均明顯高出目前現(xiàn)有技術(shù) 數(shù)據(jù)。
[0016] 所述Pichia pastoris 0phcM2菌株于2015年03月20號(hào)保藏于武漢大學(xué)中國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心，名稱(chēng)為畢赤巴斯德酵母工程菌Pichia pastoris/0phcM2,保藏號(hào)： CCTCC N0:M2015140,以下簡(jiǎn)稱(chēng) 0phcM2。
[0017] 0phcM2菌株的菌學(xué)特性：
[0018] A、形態(tài)特征：畢赤酵母屬菌種細(xì)胞呈球形、橢圓形、拉長(zhǎng)形，偶爾呈錐形，但不形成 尖頂。菌落顏色為乳白色或奶油色。無(wú)性繁殖方式為多邊芽殖。
[0019] B、生理生化特征：畢赤酵母能利用甲醇，石油，銨鹽等特殊物質(zhì)生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫 度為28°C -30°C。0phcM2除了具有畢赤酵母的生理生化外，其染色體上整合了有機(jī)磷水解 酶基因，在甲醇誘導(dǎo)條件下，能夠嚴(yán)格調(diào)控并高效分泌表達(dá)有機(jī)磷水解酶基因。（見(jiàn)背景技 術(shù)里的介紹）
【附圖說(shuō)明】：
[0020] 圖1人工合成序列OphcM與原始序列0phc2對(duì)比圖，其中灰色區(qū)域代表同源序列
[0021] 圖2優(yōu)化的氨基酸序列與原始序列對(duì)比圖，其中灰色區(qū)域代表同源區(qū)
[0022] 圖3重組載體BDM-OphcM 1-4拷貝裝配及構(gòu)建過(guò)程
[0023] 圖4畢赤酵母高效表達(dá)載體pHBM905BDM物理圖譜及重組載體構(gòu)建過(guò)程
[0024] 圖5 BDM-OphcM 1-4拷貝重組表達(dá)載體多拷貝驗(yàn)證，其中圖A所示為1-4拷貝質(zhì) 粒，圖B為所示為EcoR I和BamH I雙酶切驗(yàn)證
[0025] 圖6 BDM-0phcMl-4拷貝表達(dá)量的SDS-PAGE電泳，其中，M為蛋白質(zhì)預(yù)染marker， 1-2 泳道依次為 Pichia pastoris OphcMU Pichia pastoris 0phcM2、Pichia pastoris 0phcM3、Pichia pastoris 0phcM4 搖瓶 6 天的上清
[0026] 圖7 Pichia pastoris 0phcM2菌株發(fā)酵的SDS-PAGE電泳圖，其中M為蛋白質(zhì)預(yù) 染marker，1-8泳道依次為發(fā)酵12h，24