〇78存在的情況下，雞致病性大腸桿菌0 78黏附力為3. 62。結(jié)果表明，在SCGZ-9 黏附在Caco-2細(xì)胞上后，可以有效地排斥雞致病性大腸桿菌078對(duì)細(xì)胞的黏附，從而降低雞 致病性大腸桿菌〇 78對(duì)細(xì)胞的感染（P< 〇. 05)。
[0064] (2)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)
[0065] 將Caco-2細(xì)胞在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)成單層；PBS洗滌兩次，加入0.8mL含1% (v/v，體積濃度）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液、0.lmL雞致病性大腸桿菌078菌懸液和0.lmL乳 酸桿菌SCGZ-9菌懸液（濃度約2X107CFU/mL)，對(duì)照組只加入0. 9mL含1 % (v/v)胎牛血 清的DMEM培養(yǎng)液和0.lmL雞致病性大腸桿菌078菌懸液；37°C孵育2h;吸去菌液，PBS洗滌 三次；各孔加入lmL0. 01% (v/v)Trit〇nX-100的PBS裂解單層細(xì)胞；吸出各孔懸液，混勻， 經(jīng)倍比稀釋后取合適的稀釋度100yL涂布于LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)菌落，黏附 力用黏附細(xì)菌數(shù)10的對(duì)數(shù)值CFU/mL表示，至少3次生物學(xué)重復(fù)。
[0066] 計(jì)數(shù)結(jié)果表示，同時(shí)加入菌株SCGZ-9和雞致病性大腸桿菌078組時(shí)雞致病性大腸 桿菌〇78對(duì)細(xì)胞的黏附力為2. 35,而對(duì)照組雞致病性大腸桿菌0 78的黏附力為3. 22。結(jié)果說(shuō) 明，競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中，乳酸桿菌SCGZ-9對(duì)雞致病性大腸桿菌078在Caco-2細(xì)胞的粘附具有良好 的抑制作用（P< 〇. 05)。
[0067] (3)取代實(shí)驗(yàn)
[0068] 將Caco-2細(xì)胞在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)成單層；PBS洗滌兩次，每孔分別加入 0.9mL含1% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液、0.lmL雞致病性大腸桿菌078菌懸液，37°C孵育 2h后，吸出孔內(nèi)液體，PBS漂洗三次；分為兩組，A組每孔分別加入0.9mL含1% (v/v)胎牛 血清DMEM培養(yǎng)液、0.lmL乳酸桿菌SCGZ-9菌懸液（濃度約2X107CFU/mL)，37°C孵育2h;B 組加入0. 9mL含1 % (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液和0.lmLPBS，37°C孵育2h;吸去兩組 的菌液，PBS漂洗三次；各孔加入lmL0. 01 % (v/v)TritonX-100的PBS裂解單層細(xì)胞；吸 出各孔懸液，混勻，經(jīng)1:100稀釋后各取100yL涂布LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，24h計(jì)數(shù)菌落，黏附 力用黏附細(xì)菌數(shù)10的對(duì)數(shù)值CFU/mL表示，至少3次生物學(xué)重復(fù)。
[0069] 結(jié)果表明，A組中加入SCGZ-9菌株后，雞致病性大腸桿菌078對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏 附力為3. 37,而B組在只有雞致病性大腸桿菌078的情況下，粘附力為3. 83。說(shuō)明在雞致病 性大腸桿菌〇78先黏附細(xì)胞的情況下，SCGZ-9菌株可以排除Caco-2細(xì)胞上的部分雞致病性 大腸桿菌〇78，從而對(duì)雞致病性大腸桿菌〇 78黏附細(xì)胞起到抑制作用（P< 0. 05)。
[0070] 綜上所述，通過(guò)排斥、競(jìng)爭(zhēng)、取代三種方式，都表明了SCGZ-9菌株對(duì)雞致病性大腸 桿菌〇78黏附Caco-2細(xì)胞有明顯的抑制作用（P< 0. 05)。
[0071] 實(shí)施例4
[0072] 動(dòng)物試驗(yàn)
[0073] 一、增重試驗(yàn)
[0074] 選取體重相近的1日齡黃羽雞60只，分為甲、乙兩組，每組30只，甲組從1日齡開(kāi) 始口服乳酸桿菌SCGZ-9菌懸液（10sCFU/mL) 200yL/只，一天一次。乙組為對(duì)照組不作任 何處理，飼喂正常飼料和清水。在ld，3d，5d，7d，14d，21d，28d對(duì)兩組的雞進(jìn)行稱重，計(jì)算平 均體重和平均日增重。兩組雞平均體重的變化情況見(jiàn)圖6。
[0075] 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甲組雞的的平均體重大于對(duì)照組，而且試驗(yàn)組的雞的平均日增達(dá) 到10. 9g，大于對(duì)照組的9. 7g，兩組平均日增重經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，P< 0. 05,差異顯著，說(shuō)明本 發(fā)明SCGZ-9菌株對(duì)雞的增重有一定的促進(jìn)作用。
[0076] 二、攻菌保護(hù)試驗(yàn)
[0077] 選取體重相近的30日齡SPF雞150只，隨機(jī)分為A、B、C、D、E五組，每組30只。A組 為預(yù)防組，口服乳酸桿菌SCGZ-9菌懸液（10sCFU/mL) 200yL/只，一天一次，連續(xù)服用七天 后，經(jīng)腹腔注射濃度約10sCFU/mL的雞致病性大腸桿菌078菌懸液0. 3mL;B組為治療組，先 經(jīng)腹腔注射約10sCFU/mL的雞致病性大腸桿菌078菌懸液后，再每天口服乳酸桿菌SCGZ-9菌 懸液（10sCFU/mL) 200yL/只，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束；C組為抗生素治療組，先經(jīng)腹腔注射約10SCFU/ mL的雞致病性大腸桿菌07S菌懸液0. 3mL后，再通過(guò)飲水添加青霉素（5mg/只），連續(xù)三天； D組為攻毒對(duì)照組（陽(yáng)性對(duì)照組），經(jīng)腹腔給雞注射雞致病性大腸桿菌078菌懸液0. 3mL(濃 度約10sCFU/mL) ;E組為空白對(duì)照組，不作任何處理，正常飼喂。各組雞均飼喂不添加抗生 素的飼料，攻毒后五天內(nèi)觀察并記錄雞的死亡，精神狀況，食欲，飲水，糞便等情況，各組死 亡數(shù)情況見(jiàn)表1。
[0078] 表1攻菌保護(hù)試驗(yàn)雞的死亡情況
[0079]
[0080] 根據(jù)對(duì)各試驗(yàn)組的觀察，A組30只雞中只有6只死亡；B組雞死亡12只，18只雞 存活；C組抗生素治療的雞沒(méi)有出現(xiàn)死亡；D組攻入雞致病性大腸桿菌078后；48h內(nèi)30只雞 死亡20只，之后的兩天又繼續(xù)死亡6只；空白對(duì)照組E的雞沒(méi)有出現(xiàn)死亡。A、C兩組存活 的雞攻毒幾個(gè)小時(shí)后精神不振，但一段時(shí)間后精神恢復(fù)正常，采食、飲水正常，肛門周圍絨 毛潔凈無(wú)糞便，羽毛皮膚整齊，糞便情況正常。特別是預(yù)防組A，雞的存活數(shù)接近抗生素治療 組。而D組雞在攻入雞致病性大腸桿菌07S6h開(kāi)始發(fā)病，精神沉郁，采食和飲水量下降，拉白 色稀糞，16h開(kāi)始出現(xiàn)死亡，最終只有4只雞存活，并且存活雞精神沉郁，采食、飲水大量減 少。
[0081] 上述結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明的乳酸桿菌SCGZ-9不僅可以提高肉雞的平均日增重，促進(jìn) 雞的生長(zhǎng)發(fā)育，而且還可以有效地抑制雞致病性大腸桿菌〇7S對(duì)雞的感染，對(duì)雞起到一定的 保護(hù)作用。
[0082] 根據(jù)上述實(shí)施例，本發(fā)明的Lactobacillus ingluviei SCGZ-9菌株能有效抑制禽 源大腸桿菌的生長(zhǎng)與繁殖，可應(yīng)用于預(yù)防和/或治療禽類大腸桿菌病，或用于制備改善禽 類腸道菌群生態(tài)平衡的制劑。
[0083] 我國(guó)的家禽養(yǎng)殖環(huán)境復(fù)雜，細(xì)菌性疾病給禽的養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的危害，大腸桿 菌（Escherichia coli)，沙門氏菌（salmonella)，葡萄球菌（Staphylococcus)等都是養(yǎng)殖 過(guò)程中容易遇到的細(xì)菌性疾病。細(xì)菌性疾病還容易與病毒性疾病發(fā)生混合感染或者繼發(fā)感 染，這將使疾病更加難以控制，嚴(yán)重影響禽類養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益，加之政府和民眾對(duì)抗生素問(wèn) 題的日益關(guān)注，以后抗生素在養(yǎng)殖業(yè)上的使用將會(huì)受到嚴(yán)格的限制。
[0084] 在國(guó)外，益生菌用于增加動(dòng)物體重和預(yù)防疾病已經(jīng)有至少30年的歷史，最近幾 年，國(guó)內(nèi)的養(yǎng)殖企業(yè)也逐漸使用益生菌制品來(lái)代替一部分抗生素的使用。但由于可用的菌 株少，生產(chǎn)工藝還不成熟，防治效果不如抗生素等原因，益生菌制品在養(yǎng)殖業(yè)的使用還不太 廣泛。尋找高效、安全、抵抗力好的菌株和改進(jìn)益生菌生產(chǎn)工藝是益生菌制品能夠廣泛使用 的關(guān)鍵。
[0085] 近幾年，乳酸菌微生態(tài)制劑多層包埋及腸道靶向定植技術(shù)是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。 利用高分子材料可以對(duì)乳酸菌進(jìn)行包埋處理，可以讓乳酸菌與外界隔離，使其對(duì)外界環(huán)境 有一定的耐受能力，可以提高到達(dá)動(dòng)物腸道的乳酸菌數(shù)量，確保其能夠在特定的位置發(fā)揮 作用。因此，可以利用各種技術(shù)進(jìn)一步將本菌株制成能夠預(yù)防和/或治療禽致病性大腸桿 菌或調(diào)節(jié)禽類腸道微生態(tài)平衡的制劑，應(yīng)用與臨床生產(chǎn)上，提高禽類養(yǎng)殖業(yè)的效益。
[0086] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高效抑制禽源致病性大腸桿菌的乳酸桿菌，其特征在于：該乳酸桿菌為 Lactobacillus ingluviei SCGZ-9,于2015年05月28日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)的中 國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M 2015337。2.權(quán)利要求1所述的Lactobacillus ingluviei SCGZ-9在制備預(yù)防和/或治療禽類 致病性大腸桿菌病的制劑中的應(yīng)用。3.權(quán)利要求1所述的Lactobacillus ingluviei SCGZ-9在制備改善禽類腸道菌群生 態(tài)平衡制劑中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種高效抑制禽源致病性大腸桿菌的乳酸桿菌及其應(yīng)用。本發(fā)明的乳酸桿菌，是從健康雞群中分離得到，命名為L(zhǎng)actobacillus？ingluviei？SCGZ-9，其保藏編號(hào)為CCTCC？NO：M？2015337。Lactobacillus？ingluviei？SCGZ-9具有良好的耐酸和耐膽鹽能力，可以有效黏附在腸道細(xì)胞，并抑制禽源致病性大腸桿菌對(duì)細(xì)胞的黏附。其分泌的上清液能夠抑制禽源致病性大腸桿菌的生長(zhǎng)繁殖。因此，該菌株可應(yīng)用于制備預(yù)防和/或治療禽源致病性大腸桿菌病的制劑，或是制備改善禽類腸道菌群生態(tài)平衡的制劑。CCTCC NO：M 201533720150528
【IPC分類】A61P31/04, A61K35/747, C12R1/225, C12N1/20
【公開(kāi)號(hào)】CN105062922
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510494494
【發(fā)明人】羅開(kāi)健, 張宗堯, 廖明, 張建民, 王媚, 呂嘉敏, 黃玉梅
【申請(qǐng)人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年8月12日