一種高濃度枯草芽孢桿菌的制備方法及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高濃度枯草芽孢桿菌菌液的制備方法及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用，屬于生物制藥領(lǐng)域。
[0002]發(fā)明背景
[0003]為了控制和預(yù)防水產(chǎn)病害的流行爆發(fā)，長期以來水產(chǎn)病害控制主要依靠各種農(nóng)藥、抗生素、喹諾酮類、磺胺類、呋喃類等化學(xué)藥物及各種消毒劑。這些化學(xué)藥物和抗生素盲目使用，雖然在一定程度上可快速抑制或殺死病原菌，有效地控制疾病的發(fā)生和蔓延，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生存率。但藥物防治存在的弊端也越來越明顯，產(chǎn)生了很多負(fù)面效應(yīng):抗藥性病原株的產(chǎn)生，抗生素及化學(xué)藥物使用量逐漸加大，水產(chǎn)品中藥物殘留危及食品安全，抗藥性病菌菌株質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到人類病原菌中，增加人類疾病治療的困難程度，給人類健康帶來了巨大威脅。因此，多年的粗放式養(yǎng)殖、濫用藥物導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的食品安全問題?；谶@些負(fù)面效應(yīng)，人們開始尋找綠色安全抗生素和化學(xué)藥物的替代品用于水產(chǎn)動(dòng)物疾病的防治。用微生物制劑改善養(yǎng)殖水體微生態(tài)環(huán)境受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。
[0004]枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilisCohn)是一種好氧的革蘭氏陽性菌。它能夠大量消耗水體中的有機(jī)質(zhì)，將其分解為小分子有機(jī)酸、氨基酸及氨，改善水質(zhì)，為單胞藻提供營養(yǎng)；還可使腸道pH值及氨濃度降低，產(chǎn)生較強(qiáng)活性的蛋白酶和淀粉酶，促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的消化；也能抑制病原菌的滋生和提高動(dòng)物的免疫力。鑒于此，枯草芽孢桿菌已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。在水體或飼料中添加枯草芽孢桿菌制劑，可以有效抑制或殺滅水體中或養(yǎng)殖生物體內(nèi)的某些有害致病菌，并且能增強(qiáng)有益菌群落，而達(dá)到防治水產(chǎn)疾病的目的。
[0005]現(xiàn)階段的實(shí)驗(yàn)室研究和工業(yè)化生產(chǎn)中，存在著發(fā)酵周期長、芽孢形成率低、數(shù)量少、成本高等一系列問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

:
[0006]本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種制備高濃度枯草芽孢桿菌菌液的制備方法，該芽孢桿菌菌液在提高水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品品質(zhì)方面效果更佳。
[0007]本發(fā)明在山東日照、青島近海的海水養(yǎng)殖區(qū)分離得到一株凈化水質(zhì)的枯草芽孢桿菌，其特征如下:表面厚而粗糙，不透明的灰白色菌落，在營養(yǎng)肉湯中形成菌膜及少量沉淀，革蘭氏染色陽性，呈桿狀，中生橢圓形芽孢，該菌發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不發(fā)酵甘露醇、乳糖，V-P測(cè)定陽性，硝酸鹽還原陽性，明膠陽性，過氧化氫陽性。
[0008]—種高濃度枯草芽孢桿菌菌液的生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
[0009]本發(fā)明所涉及的高濃度枯草芽孢桿菌菌液(Bacillus subf ilisCohn)的制備工藝為:按5%的比例將經(jīng)山東日照、青島近海的海水養(yǎng)殖區(qū)采集的原始芽孢桿菌接種至種子培養(yǎng)基中，在35-55°C下培養(yǎng)12-48h，再以10%的接種量擴(kuò)大至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35-55°C，通氣量為5-10L/min，攪拌速度為150_300rpm，pH在7.2?7.4之間，培養(yǎng)72-100h，制得高濃度生產(chǎn)用菌劑。
[0010]優(yōu)選地，所述的種子培養(yǎng)基成分如下??每100mL水中含酵母提取物Sg，胰蛋白胨10g，蔗糖20g，磷酸氫二鉀2.5g，磷酸二氫鉀lg，pH 7.3。
[0011]優(yōu)選地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下:玉米粉Sg，尿素5g，酵母膏l(xiāng)g，豆汁10g，KH2PO40.5g，K2HPO40.8g，MgSO4.7H20 0.15g，MnSO4.H2O 0.02g，聚丙二醇 20002.4g，水lOOOmL，121°C實(shí)消滅菌20min，冷卻至室溫。
[0012]優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)溫度均為37°C，
[0013]優(yōu)選地，所述的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)間為36h。
[0014]優(yōu)選地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中通氣量為5-10L/min，攪拌速度為150_300rpm，pH在7.2?7.4之間，培養(yǎng)時(shí)間為72-100h。
[0015]發(fā)酵完成后的高濃度枯草芽孢桿菌發(fā)酵液即為制備好的微生物制劑。
[0016]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0017]本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌菌液在5%的接種條件下在10h內(nèi)菌種總數(shù)可達(dá)
7.5X1010CFU/mL(山東省分析測(cè)試中心檢驗(yàn))，數(shù)量遠(yuǎn)高于目前現(xiàn)有技術(shù)，具有高效和高產(chǎn)的特點(diǎn)。
[0018]將本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌菌液應(yīng)用于池塘養(yǎng)魚的微生態(tài)調(diào)控研究上，可極大提高養(yǎng)殖水體氨氮降解率、磷酸鹽降解率及亞硝酸鹽降解率，凈化養(yǎng)殖水質(zhì)，為今后益生菌制劑的大規(guī)模應(yīng)用提供了使用技術(shù)指導(dǎo)，且具有較高的科研及市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明的生產(chǎn)及使用流程圖。
[0020]圖2為本發(fā)明專利生產(chǎn)的枯草芽胞桿菌菌液對(duì)池塘養(yǎng)殖水體磷酸鹽濃度的影響。
[0021]圖3為本發(fā)明專利生產(chǎn)的枯草芽胞桿菌菌液對(duì)池塘養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽濃度的影響。
[0022]圖4為枯草芽胞桿菌菌液對(duì)養(yǎng)殖水體氨氮濃度的影響。
[0023]圖5為枯草芽胞桿菌菌液使用方式對(duì)養(yǎng)殖水體營養(yǎng)鹽濃度影響。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0025]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑。
[0026]以下實(shí)施例中所涉及的培養(yǎng)基為:
[0027](I)促芽培養(yǎng)基??每100mL水中含蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，玉米粉0.5g，酵母膏 0.lg, pH 7.2-7.4。
[0028](2)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:每100mL水中含蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，瓊脂15g，pH 7.2-7.4o
[0029](3)種子培養(yǎng)基:每100mL水中含酵母提取物8g，胰蛋白胨10g，蔗糖20g，磷酸氫二鉀2.5g，磷酸二氫鉀lg，pH 7.3
[0030](4)發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉8g，尿素5g，酵母膏l(xiāng)g，豆汁10g，KH2P040.5g，K2HPO40.8g，MgSO4.7H20 0.15g，MnSO4.H2O 0.02g，聚丙二醇 20002.4g，水 100mL0
[0031]實(shí)施例1
[0032]1.菌種來源:山東日照、青島近海的海水養(yǎng)殖區(qū)，具體分離方法如下:
[0033](I)富集:取5g養(yǎng)殖區(qū)底泥放入含有50mL無菌水的三角瓶中(帶玻珠)，震蕩15min，取5mL菌懸液加入45mL促芽培